大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療彌漫性泛細(xì)支氣管炎作用機(jī)理探討.pdf

1、前言：以紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類分子中含內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的大環(huán)而得名的抗生素，這個(gè)內(nèi)酯環(huán)通常為12-20元環(huán)，也可更多，最初的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是從鏈霉菌分離出來，此后在其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上陸續(xù)研究開發(fā)出一系列抗菌活性強(qiáng)，不良反應(yīng)少的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，如羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素等，其主要抗菌機(jī)制是阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抑菌或殺菌作用。自從工藤翔二等學(xué)者首先報(bào)道長(zhǎng)期小劑量紅霉素治療彌漫性泛細(xì)支氣管炎(diffusepanbronchio

2、litis，DPB)取得明顯效果以來，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抗炎活性逐漸成為研究熱點(diǎn)。
　　 在DPB患者支氣管肺泡灌洗液(Bronchioalveolar Lavage Fluid，BALF)中，T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組，DPB組織病理特點(diǎn)是淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及組織細(xì)胞等浸潤(rùn)致管壁增厚，伴有支氣管相關(guān)淋巴組織(bronchus-associatedtissue，BALT)增生，明顯高于其它呼吸道疾病，加之肉芽組織及瘢痕灶的

3、形成致呼吸性細(xì)支氣管壁增厚、管腔狹窄和閉塞，繼而引發(fā)細(xì)支氣管擴(kuò)張。DPB病理結(jié)果顯示，除中性粒細(xì)胞外，淋巴細(xì)胞在DPB發(fā)生和發(fā)展過程中也是十分重要的細(xì)胞成分。T細(xì)胞可通過分泌多種與炎癥形成有關(guān)的細(xì)胞因子，如TNF-α、白細(xì)胞介素IL-2和IL-1等細(xì)胞因子，同時(shí)，T淋巴細(xì)胞自身也可分泌一種趨化多種炎性細(xì)胞的趨化性細(xì)胞因子-巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatoryprotein-1α，MIP-1α)[18，2

4、3]，所產(chǎn)生的細(xì)胞因子反過來又可激活淋巴細(xì)胞，免疫活化的淋巴細(xì)胞分別產(chǎn)生淋巴因子或抗體，造成炎癥反應(yīng)周而復(fù)始，連綿不斷，呈慢性經(jīng)過，故T淋巴細(xì)胞對(duì)DPB的發(fā)生和病理的持續(xù)性進(jìn)展起著重要作用，并且已有研究表明DPB患者存在T淋巴細(xì)胞凋亡不足的現(xiàn)象。
　　 MIP-1α是T淋巴細(xì)胞及多種炎性細(xì)胞分泌的一種趨化性細(xì)胞因子，能趨化多種炎性細(xì)胞，其在激活淋巴細(xì)胞，促使其黏附于血管內(nèi)皮而遷移和建立化學(xué)趨化梯度的過程中起著重要作用。已有研究表

5、明在DPB患者BALF中MIP-1α明顯高于正常對(duì)照組。
　　 鑒于T淋巴細(xì)胞及其分泌的趨化性細(xì)胞因子-MIP-1α在炎癥反應(yīng)中的重要作用，我們將其引入DPB的系列研究，比較十四元環(huán)紅霉素(erythromycin，EM)和十五元環(huán)阿奇霉素(azithromycin，AZM)對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和MIP-1α表達(dá)的影響，以探討大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療DPB的作用機(jī)理。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 第一部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)部分
　

6、　 1、EM和AZM對(duì)T淋巴細(xì)胞MIP-1α表達(dá)的影響：用10％胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)DMEM培養(yǎng)液(100u/mL青霉素，100μg/ml鏈霉素)體外培養(yǎng)人T淋巴細(xì)胞(Jurkat T cell)，各孔中加入5種濃度(6.25、12.5、25、50和100μg/mL)的紅霉素或阿奇霉素，兩種藥物溶解于二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide，DMSO：終濃度<0.1％)中并設(shè)立陰性對(duì)照孔培養(yǎng)2

7、4h后，收集細(xì)胞采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)方法測(cè)定MIP-1αmRNA的表達(dá)，上清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行MIP-1α蛋白的測(cè)定。
　　 2、EM和AZM對(duì)T淋巴細(xì)胞調(diào)亡的影響：用10％胎牛血清(fetal bovi

8、neserum，F(xiàn)BS)RPMI1640(100u/mL青霉素，100μg/ml鏈霉素)體外培養(yǎng)人T淋巴細(xì)胞(Jurkat T cell)，按照12.5μg/mL、100μg/mL和200μg/mL3種濃度分別加入紅霉素或阿奇霉素，兩種藥物溶解于DMSO(終濃度<0.1％)，同時(shí)設(shè)立只加DMSO而不加上述藥物的陰性對(duì)照孔培養(yǎng)48h。采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡，Western blotting法檢測(cè)

9、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)≥3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS12.0軟件包的配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分臨床病例研究部分
　　 EM和AZM對(duì)DPB患者T淋巴細(xì)胞調(diào)亡的影響：(1)、分離DPB患者外周靜脈淋巴細(xì)胞及體外培養(yǎng)：收集初次診斷的DPB病例(未應(yīng)用過紅霉素及阿奇霉素等相關(guān)藥物)，抽取新

10、鮮外周靜脈血于無(wú)菌肝素鋰抗凝血試劑管中，2小時(shí)內(nèi)體外采用淋巴細(xì)胞分離液無(wú)菌過程分離淋巴細(xì)胞并將細(xì)胞用10％FBS細(xì)胞培養(yǎng)液(100u/mL青霉素，100μg/ML鏈霉素)稀釋培養(yǎng)。(2)、觀察EM和AZM對(duì)DPB患者T淋巴細(xì)胞調(diào)亡的影響：按照12.5μ/mL、100μ/mL和200μg/mL3種濃度分別加入紅霉素或阿奇霉素，兩種藥物溶解于DMSO(終濃度<0.1％)，同時(shí)設(shè)立只加DMSO而不加上述藥物的陰性對(duì)照孔培養(yǎng)48h。采用流式細(xì)胞

11、儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡，Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。(3)、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)≥3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS12.0軟件包的配對(duì)t檢驗(yàn)分析進(jìn)行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、EM和AZM對(duì)T淋巴細(xì)胞MIP-1α表達(dá)的影響：RT-PCR

12、結(jié)果顯示紅霉素或阿奇霉素均可抑制MIP-1α的mRNA相對(duì)表達(dá)(P<0.05)。阿奇霉素和紅霉素在12.5μg/mL時(shí)的表達(dá)水平降低較明顯，陰性對(duì)照組MIP-1α的mRNA相對(duì)表達(dá)值1.094±0.08，阿奇霉素作用后MIP-1αmRNA相對(duì)表達(dá)值0.91±0.09，紅霉素作用后MIP-1αmRNA相對(duì)表達(dá)值0.96±0.06。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各化合物上清液MIP-1α蛋白表達(dá)與陰性對(duì)照組比較均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

13、5)，其中在12.5μg/mL時(shí)蛋白水平的表達(dá)降低較明顯，阿奇霉素使MIP-1α下降41％，紅霉素使之降低35％。
　　 2、EM和AZM對(duì)T淋巴細(xì)胞調(diào)亡的影響：流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)顯示，紅霉素(100μg/mL和200μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL和200μg/mL)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性(P<0.05)，其中阿奇霉素較紅霉素作用明顯，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而12.5μg

14、/mL組兩抗生素未呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡(P>0.05)，從細(xì)胞凋亡角度解釋了第一部分實(shí)驗(yàn)中EM和AZM在低劑量(12.5μg/mL)抑制.MIP-1α表達(dá)的作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用無(wú)關(guān)。Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；隨EM/AZM濃度的增加Active Caspas--3蛋白表達(dá)逐漸增加，使Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少，AZM使Bax蛋白逐漸增加，而EM使Bax蛋白表達(dá)不變。
　　 二、臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　

15、EM和AZM對(duì)DPB患者T淋巴細(xì)胞調(diào)亡的影響；流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI法檢測(cè)顯示，紅霉素及阿奇霉素對(duì)臨床初診DPB患者外周血T淋巴細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，實(shí)驗(yàn)組(100和200μg/mL)細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，其中AZM較EM明顯，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，12.5μg/mL組兩抗生素未呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡(P>0.05)，基礎(chǔ)及臨床的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均從細(xì)胞凋亡角度解釋了第一部分實(shí)驗(yàn)中EM和AZM在12.51μg

16、/mL抑制MIP-α表達(dá)的作用可能與它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用無(wú)關(guān)。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)顯示隨EM/AZM濃度的增加Active Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少，Bax蛋白表達(dá)不變。由于NF-kB在多種炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生與釋放和炎癥細(xì)胞的凋亡中均具有重要意義，并已有文獻(xiàn)報(bào)道大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有抑制T淋巴細(xì)胞NF-kB活化作用，我們推測(cè)EM和AZM在12.5μg/mL抑制MIP-1α表達(dá)及

17、在100μg/mL、200μg/mL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)可能是通過抑制NF-kB活性實(shí)現(xiàn)的，兩種效應(yīng)可能作用的靶點(diǎn)不同。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 結(jié)論
　　 紅霉素及阿奇霉素均具有誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的作用，其中阿奇霉素較紅霉素作用明顯。EM、AZM可使T淋巴細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白的比值上調(diào)，活性Caspase-3蛋白表達(dá)增加，推測(cè)AZM和EM通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)激活Caspase-3，使處理后的細(xì)

18、胞呈程序性死亡，從而對(duì)DPB患者T淋巴細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 紅霉素和阿奇霉素還可通過抑制T淋巴細(xì)胞MIP-1α的產(chǎn)生，降低對(duì)各炎性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞的趨化聚集，減少與DPB的病理過程密切相關(guān)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生與釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，目前尚未見到有關(guān)MIP-1α藥物抑制劑的報(bào)道，因此，大環(huán)內(nèi)酯類化合物對(duì)MIP-1α功能的影響是探索該類化合物抗炎作用機(jī)制的一個(gè)全新的切入點(diǎn)和角度，并為研發(fā)治療炎癥性疾病的新藥提供新的作用靶點(diǎn)。