C-EBPs誘餌寡核苷酸對膿毒癥小鼠多器官損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、背景及目的:膿毒癥（sepsis）是感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（system inflammatory response syndrome，SIRS），是重癥監(jiān)護病房(ICU)內(nèi)常見并發(fā)癥及首要死亡原因。膿毒癥治療花費高，醫(yī)療資源消耗大，對人類健康和社會經(jīng)濟造成巨大威脅。CCAAT增強子結(jié)合蛋白（CCAAT enhancer binding protein，C/EBPs）是一組屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic region leucin

2、ezipper, bZIP)家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，目前已發(fā)現(xiàn)6個成員:α、β、γ、δ、ε和ξ。其中成員α、β、δ及ε在各種炎癥性疾病急性期反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且作為轉(zhuǎn)錄因子有著共同的特異性識別序列RTTGCGYAAY（其中R為A或G，Y為C或T）。因此，為了尋找新的膿毒癥防治靶點，本研究采用轉(zhuǎn)錄因子誘餌策略(transcription factor decoy strategy, TFDs)體外合成針對轉(zhuǎn)錄因子C/EBPs的啞鈴形誘餌寡脫

3、氧核苷酸(C/EBPs decoy ODNs)，然后探討了C/EBPs decoy ODNs對膿毒癥的影響及其機制。
　　方法:1）體外實驗:先采用免疫印跡分析(western blot，WB)及凝膠滯留實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)觀察LPS(1μg/mL)刺激下RAW264.7細(xì)胞內(nèi)C/EBPs蛋白表達水平及DNA結(jié)合活性的變化以期驗證C/EBPs在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重

4、要作用;然后設(shè)計合成針對轉(zhuǎn)錄因子C/EBPs的特異性啞鈴形decoy ODNs及用于對照的突變寡脫氧核苷酸(C/EBPs mutant ODNs)，在采用電泳及EMSA驗證ODNs的合成符合設(shè)計要求后用陽離子轉(zhuǎn)染試劑TurboFect將熒光基團FAM標(biāo)記的ODNs轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測ODNs轉(zhuǎn)染效率;Hoechst染核后經(jīng)熒光顯微鏡觀察decoy ODNs在細(xì)胞內(nèi)的分布;alamarBlue實驗觀察ODNs

5、的細(xì)胞毒性;WB觀察其對C/EBPs蛋白表達水平的影響;采用ELISA檢測C/EBPs decoy ODNs對LPS（1μg/mL）刺激下RAW264.7細(xì)胞上清中細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β及IL-6的表達影響;采用Real-time PCR檢測C/EBPs decoy ODNs對LPS(1μg/mL)刺激下RAW264.7細(xì)胞內(nèi)多個C/EBPs炎癥相關(guān)靶基因的表達影響。2）體內(nèi)試驗:采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)制備膿毒癥小鼠模型，經(jīng)

6、量效實驗和時效實驗觀察C/EBPs decoy ODNs對膿毒癥小鼠存活率的影響;尾靜脈注射FAM標(biāo)記的C/EBPs decoy ODNs6h及24h后檢測組織勻漿上清熒光密度觀察decoy ODNs的器官分布及停留情況;然后通過檢測反應(yīng)多器官損傷的血清生化指標(biāo)及多器官光鏡下形態(tài)學(xué)變化觀察C/EBPs decoy ODNs對膿毒癥小鼠多器官損傷的保護作用;采用ELISA檢測C/EBPs decoy ODNs對膿毒癥小鼠血清細(xì)胞因子TNF

7、-α，IL-1β及IL-6的表達影響，采用Real-time PCR檢測C/EBPs decoy ODNs對肺組織中多個C/EBPs炎癥相關(guān)靶基因表達的影響。
　　結(jié)果:1）體外實驗:RAW264.7細(xì)胞中CEBPα蛋白在基礎(chǔ)狀態(tài)下表達較高，LPS刺激后1h即開始降低，于6h降到最低峰，之后又開始上升，于24h恢復(fù)到基礎(chǔ)水平;CEBPβ基礎(chǔ)水平較低，LPS刺激后1h即開始升高，于12h達到高峰，24h又開始下降，但仍高于基礎(chǔ)水平;

8、CEBPδ基礎(chǔ)水平較低，LPS刺激后1h即開始升高，一直持續(xù)至24h;CEBPε于LPS刺激后6h開始升高，24h又開始下降，但仍高于基礎(chǔ)水平。細(xì)胞核中CEBPα、β、δ及ε的表達變化與其在細(xì)胞總蛋白中的表達情況基本一致;但CEBPα蛋白在LPS刺激后6h才開始降低;CEBPε則于LPS刺激后1h則有所下降，于3h開始升高，一直持續(xù)至24h。C/EBPsDNA結(jié)合活性在LPS刺激后1h即開始增加，于6h和12h時達到高峰，C/EBPs的

9、這種高水平的DNA結(jié)合活性一直持續(xù)到24h;且CEBPβ及CEBPδ的DNA結(jié)合活性遠(yuǎn)高于CEBPα和CEBPε。電泳及EMSA結(jié)果表明C/EBPs decoy ODNs和mutant ODNs符合設(shè)計要求。轉(zhuǎn)染ODNs4h之后，RAW264.7細(xì)胞C/EBPs decoy ODNs和C/EBPs mutant ODNs的轉(zhuǎn)染效率分別為87.35％及87.71％;熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染4h之后decoy ODNs大部分定位于細(xì)胞核;

10、C/EBPs decoy ODNs和mutantODNs均無明顯細(xì)胞毒性作用;C/EBPs decoy ODNs和mutant ODNs不影響RAW264.7細(xì)胞中CEBPα、β、δ及ε蛋白表達水平。C/EBPs decoyODNs能抑制LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞TNF-α，IL-1β及IL-6的表達。C/EBPs decoy ODNs能抑制LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞IL-6，IL-1β，IL-18,MCP-1,MIF, c

11、aspase-1,NF-κB1,ICAM1,VCAM1和Fgα的mRNA表達。2）體內(nèi)試驗:量效實驗表明CLP后立即給予小劑量(10μg)、中劑量(30μg)、大劑量(90μg) C/EBPs decoy ODNs干預(yù)分別可使CLP所致的膿毒癥小鼠存活率提高30％、60％及70％; C/EBPsmutant ODNs干預(yù)則對膿毒癥小鼠存活率無明顯影響。時效實驗發(fā)現(xiàn)術(shù)后0、3、6、12h給予C/EBPs decoy ODNs(30μg)干

12、預(yù)可使膿毒癥小鼠存活率提高60％、50％、40％及30％。尾靜脈注射6h后，C/EBPsdecoy ODNs在肝、肺、腎組織中均有分布;注射24h之后，C/EBPs decoyODNs在肝、肺組織中仍有停留，而腎組織中則已檢測不到。C/EBPsdecoy ODNs降低膿毒癥小鼠血清生化指標(biāo)BUN，Cr, ALT, AST, LDH及CK-MB水平，減輕其心、肝、肺、腎的組織損傷;C/EBPs decoy ODNs降低膿毒癥小鼠血清炎癥因

13、子TNF-α，IL-1β及IL-6表達水平;C/EBPsdecoy ODNs降低膿毒癥小鼠肺組織多個炎癥相關(guān)因子IL-6，IL-1β，IL-18,MCP-1,MIF, caspase-1,NF-κB1,ICAM1,VCAM1及Fgα的mRNA表達。
　　結(jié)論:C/EBPs在LPS所致的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可作為膿毒癥防治的潛在干預(yù)靶點;C/EBPs decoy ODNs通過干擾C/EBPsDNA結(jié)合活性而抑制多個炎癥相關(guān)靶基因