四環(huán)素衍生物CMT-3抗癌作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、癌癥,又名惡性腫瘤,目前為危害人類健康最重要的疾病之一。對于惡性腫瘤,迄今為止世界各國醫(yī)學(xué)界仍無有效的治愈手段。雖然近年出現(xiàn)的免疫治療、基因治療、傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥治療等不斷發(fā)展,但以手術(shù)、放療和化療為主的傳統(tǒng)方法仍為當(dāng)前治療癌癥的三大重要手段。然而這些方法都分別有其各自的局限性。由于手術(shù)治療具有創(chuàng)傷大,治愈率差,易發(fā)生轉(zhuǎn)移等缺陷,而放化療也常常使患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、局部組織放射性損傷、全身白細(xì)胞減少、免疫力低下等毒副反應(yīng)癥狀。因此,研究毒

2、性低、腫瘤選擇性強(qiáng)的新一代的抗腫瘤藥物是腫瘤治療急需解決的課題和新方向,具有應(yīng)用于腫瘤臨床治療的實(shí)際應(yīng)用價值。
　　CMT-3(Chemically modified tetracyclines-3)為四環(huán)素(廣譜抗菌素)類衍生物,或稱為4-去二甲基氨基山環(huán)素。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來講,CMT-3是將四環(huán)素去除了二甲氨基,甲基和羥基的功能基團(tuán)。因此,其抗菌的功能被去除,但是卻保留了抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能。由于基質(zhì)金屬蛋白酶(

3、MMPs)與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),已有的研究成果表明,CMT-3在抑制人乳腺癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移中均具有明顯的作用,提示其可作為一種廣譜抗腫瘤新藥。目前除了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的研究,CMT-3已被深入到臨床試驗(yàn)研究的階段。然而,通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),目前對于CMT-3在抗癌作用方面缺乏全面系統(tǒng)的研究,并且其抗癌機(jī)制也尚不明確,因此缺乏可靠的理論依據(jù),限制了其臨床應(yīng)用。
　　類似于臨床使用的常規(guī)化療藥物,在臨床試驗(yàn)的研究中

4、,CMT-3也可使腫瘤患者產(chǎn)生明顯的毒副作用(如頭痛,惡心等)。丹參酮IIA磺酸鈉注射液(TSN-SS)為一種丹參提取物,由于其對于心血管疾病具有較好的療效而廣泛用于臨床。除此之外,目前也有研究表明,TSN-SS具有一定的抗癌以及化療增敏作用。因此,本課題在深入探討CMT-3抗癌效應(yīng)和機(jī)制的同時,也首次將TSN-SS聯(lián)合應(yīng)用于CMT-3,旨在為腫瘤的臨床治療提供新型方案以及理論基礎(chǔ)。本課題的研究內(nèi)容共分為以下三個部分。
　　第一部

5、分 CMT-3抑制癌細(xì)胞生長以及遷移能力的研究
　　目的:研究CMT-3對不同p53狀態(tài)癌細(xì)胞生長的影響,及其對宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移能力的影響。以正常人乳腺細(xì)胞HBL-100,小鼠成纖維細(xì)胞L929和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7作為對照,同時以順鉑、紫杉醇和吡柔比星常規(guī)化療藥作為對照,初步探討其作用機(jī)制。
　　方法:MTT法檢測不同濃度CMT-3對乳腺癌MCF-7/MDA-MB-231、宮頸癌HeLa/Siha、肺癌NCI

6、-H1975/NCI-H446等細(xì)胞的生存率的影響;MTT法檢測同一濃度CMT-3、順鉑、紫杉醇和吡柔比星對乳腺癌MCF-7、宮頸癌HeLa和肝癌HepG2細(xì)胞生存率的影響;采用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析CMT-3及其聯(lián)合p53抑制劑PTF-α對癌細(xì)胞增殖的影響;通過貼壁實(shí)驗(yàn)方法檢測CMT-3處理后宮頸癌HeLa細(xì)胞的粘附能力的變化;采用劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)檢測CMT-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移能力的影響;通過Transwell法檢測CMT-3對宮頸癌He

7、La細(xì)胞侵襲能力的影響;Western Blot法測定p53以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá);明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
　　結(jié)果:(1)CMT-3能明顯抑制乳腺癌MCF-7/MDA-MB-231、宮頸癌HeLa/Siha、肺癌NCI-H1975/NCI-H446等細(xì)胞的生長,并呈時間依賴和濃度依賴關(guān)系;
　　(2)癌細(xì)胞對CMT-3的敏感性具有組織類型之間的差異,其中肺癌細(xì)胞株對CMT-3較不敏感,而乳腺癌、肝癌細(xì)胞株

8、相對較敏感;
　　(3)癌細(xì)胞對CMT-3的敏感性與p53狀態(tài)相關(guān),同一組織類型的癌細(xì)胞中,p53野生型細(xì)胞株相對p53突變型細(xì)胞更為敏感;
　　(4)與臨床使用的常規(guī)化療藥相比較,CMT-3對于宮頸癌HepG2和宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的抑制作用優(yōu)于順鉑和吡柔比星,對于乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用甚至優(yōu)于紫杉醇;
　　(5)CMT-3能明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的增殖,聯(lián)合PTF-α卻減弱了

9、CMT-3抑制癌細(xì)胞增殖的能力,可能與p53蛋白表達(dá)的變化相關(guān);
　　(6)CMT-3可以抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的粘附、遷移及侵襲能力,呈時間依賴關(guān)系;
　　(7)CMT-3能明顯抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性。
　　結(jié)論:(1)CMT-3具有抑制多種組織類型癌細(xì)胞生長和增殖的能力,其效果優(yōu)于順鉑、吡柔比星和紫杉醇;
　　(2)癌細(xì)胞對CMT-3的敏感性與組織類型和p53狀態(tài)相關(guān),其中乳腺癌、肝癌細(xì)胞株相

10、對較敏感,p53野生型細(xì)胞株相對較敏感;
　　(3)CMT-3抑制癌細(xì)胞生長和增殖的機(jī)制可能與p53蛋白表達(dá)的變化相關(guān);
　　(4)CMT-3可以抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的粘附、遷移及侵襲能力,其機(jī)制與抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性相關(guān)。
　　第二部分 CMT-3抗宮頸癌作用及其機(jī)制的研究
　　目的:研究CMT-3對宮頸癌Hela和Siha細(xì)胞形態(tài)、周期阻滯和凋亡等的影響。并且建立裸鼠宮頸癌異位移植瘤模型,

11、觀察CMT-3在動物體內(nèi)對宮頸癌細(xì)胞生長的抑制作用。另外,觀察CMT-3與X-線聯(lián)合作用對于HeLa細(xì)胞的抑制作用。
　　方法:采用活細(xì)胞工作站觀察不同濃度和時間CMT-3作用后HeLa和Siha細(xì)胞形態(tài)的變化;MTT法檢測CMT-3與Caspase-9聯(lián)合使用后對HeLa細(xì)胞生存的影響;MTT法以及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CMT-3與X-線聯(lián)合作用對于HeLa細(xì)胞的抑制作用;應(yīng)用活性氧檢測試劑盒測定CMT-3處理后HeLa細(xì)胞中ROS(

12、Reactive oxygen species)的變化;通過流式細(xì)胞術(shù)分析CMT-3作用后細(xì)胞周期的變化;Annexin V和PI雙染法檢測CMT-3及其聯(lián)合ROS抑制劑NAC誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況;免疫熒光法分析CMT-3處理后Siha細(xì)胞NF-κB的分布;PCR法檢測CMT-3處理后Siha細(xì)胞Cyclin E的轉(zhuǎn)錄情況;Western Blot法測定CMT-3對宮頸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。
　　建立Babl/C

13、裸鼠臀部HeLa細(xì)胞移植瘤模型,按處理因素分組,分別為生理鹽水對照組;空載體組(1％羧甲基纖維素鈉/載體脂質(zhì)納米粒,1次/4天,ig/ip);順鉑陽性對照組(5mg/kg,1次/周,ip);CMT-3口服給藥組(溶劑:1％羧甲基纖維素鈉,20mg/kg,1次/4天,ig)和CMT-3注射給藥組(載體:脂質(zhì)納米粒,6mg/kg,1次/4天,ip)。連續(xù)給藥治療28天,期間觀察動物一般生命體征的改變和腫瘤體積的變化,采用透射電鏡檢測腫瘤組織

14、中超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:(1)CMT-3能促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞皺縮變圓,發(fā)生凋亡式的細(xì)胞形態(tài)改變,但是相同處理條件下CMT-3并不引起Siha細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生類似改變;
　　(2)相比于X-線單獨(dú)照射組,CMT-3與X-線聯(lián)合作用對于HeLa細(xì)胞的生長無明顯影響;
　　(3)CMT-3能夠增加HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生,而NAC卻明顯抑制了該效應(yīng)的發(fā)生;
　　(4)CMT-3促進(jìn)HeL

15、a細(xì)胞內(nèi)LC3-I及LC3-II的表達(dá);
　　(5)CMT-3促進(jìn)Siha細(xì)胞阻滯于G0/G1期,卻不引起其發(fā)生凋亡;
　　(6)CMT-3能明顯上調(diào)HeLa細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(cleaved-caspase-9,cleaved-caspase-3,cleaved-PARP),下調(diào)pro-caspase-9,caspase-3,PARP以及凋亡抑制蛋白Bcl-2和NF-κB的表達(dá);
　　(7)CMT-3可以抑

16、制Siha細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin E的表達(dá)而不影響其轉(zhuǎn)錄,并且誘導(dǎo)NF-κB由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位;
　　(8)CMT-3在口服給藥劑量下(20mg/kg)對荷瘤裸鼠產(chǎn)生一定的毒副作用,引起裸鼠體重發(fā)生下降,并且出現(xiàn)輕度焦慮反應(yīng),而注射給藥劑量(6mg/kg)無明顯的毒副作用;
　　(9)CMT-3能明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞移植腫瘤的生長,這種抑制作用優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物順鉑;
　　(10)CMT-3能誘導(dǎo)移植瘤組織發(fā)生

17、凋亡和自噬。
　　結(jié)論:(1)CMT-3能在體內(nèi)外抑制宮頸癌細(xì)胞的生長,HeLa細(xì)胞對于CMT-3的敏感性高于Siha細(xì)胞;
　　(2)CMT-3在HeLa細(xì)胞中并不具有放療增敏作用;
　　(3)CMT-3能在體內(nèi)外誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡,其機(jī)制與ROS引起的內(nèi)源性線粒體凋亡通路相關(guān);
　　(4)CMT-3能在體內(nèi)外誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬;
　　(5)而Siha細(xì)胞對CMT-3相對不敏感,可能與NF-κ

18、B由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而抑制Cyclin E的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯相關(guān);
　　(6)脂質(zhì)納米粒載體能增加CMT-3的水溶性,同時也降低了用藥劑量,提高了CMT-3對于HeLa細(xì)胞移植瘤的療效。
　　第三部分 CMT-3聯(lián)合TSN-SS誘導(dǎo)自噬以及HMGB1釋放效應(yīng)的研究
　　目的:研究CMT-3誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬以及HMGB1釋放效應(yīng),檢測其聯(lián)合TSN-SS抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長,并且探討相關(guān)

19、的作用機(jī)制。
　　方法:Western Blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3以及HMGB1的表達(dá)情況;免疫熒光法檢測HMGB1定位的變化;建立GFP-LC3轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞穩(wěn)定株,通過熒光顯微鏡觀察自噬體的產(chǎn)生;MTT法檢測CMT-3及其聯(lián)合TSN-SS處理后對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用;。
　　結(jié)果:(1)CMT-3能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)LC3-I和LC3-II的表達(dá)增加,聯(lián)合自噬抑制劑Baf A1進(jìn)一步增加了LC3-I

20、I表達(dá)的增加;
　　(2)CMT-3能誘導(dǎo)HMGB1由胞漿向胞核最終向細(xì)胞外液釋放;
　　(3)與CMT-3單獨(dú)處理組相比CMT-3與自噬抑制劑聯(lián)合使用能增加細(xì)胞漿中HMGB1的表達(dá);
　　(4)相比于CMT-3單獨(dú)處理組,CMT-3聯(lián)合TSN-SS能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞的生長;
　　(5)CMT-3聯(lián)合TSN-SS處理后,HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成以及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯增加;
　　(6)聯(lián)合TS