急性哮喘小鼠中T-bet通過IL-23受體對(duì)Th17細(xì)胞增殖和致炎機(jī)能的影響.pdf

1、第一部分、急性哮喘小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)
　　 目的：通過補(bǔ)充完善急性哮喘動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，探討建立的急性哮喘小鼠模型是否成功。
　　 方法：35只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組：哮喘組(20只)以O(shè)VA致敏、激發(fā)；正常對(duì)照組(15只)以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā)，末次激發(fā)24 h后處理小鼠。查看小鼠的一般行為活動(dòng)；霧化吸入Ach行支氣管激發(fā)試驗(yàn)，有創(chuàng)肺阻抗法測(cè)定小鼠的氣道反應(yīng)性；BALF行細(xì)胞學(xué)分類、計(jì)

2、數(shù)；HE染色觀察肺組織的病理變化。研磨小鼠脾臟制成單個(gè)核細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，免疫磁珠分離小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞，懸于加有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時(shí)后，計(jì)算脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)；流式儀檢測(cè)Th17細(xì)胞的陽性率；ELISA測(cè)定BALF和脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-17的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 (1)哮喘組小鼠出現(xiàn)類似于人的哮喘發(fā)作癥狀，而正常對(duì)照組小鼠表現(xiàn)

3、正常。
　　 (2)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠對(duì)Ach的刺激反應(yīng)明顯，濃度反應(yīng)曲線上移(均P<0.01)。
　　 (3)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)浸潤(rùn)(P<0.01)。
　　 (4)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、Neu(％)、Eos(％)和Lym(％)顯著增多(均P<0.01)。
　　 (5)與正

4、常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)和Th17細(xì)胞陽性率顯著增高(均P<0.01)。
　　 (6)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠BALF和脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-17的濃度顯著增高(均P<0.01)。
　　 (7)急性哮喘小鼠BALF中IL-17的濃度與Neu(％)顯著正相關(guān)(r=0.903，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.對(duì)脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)、Th17細(xì)胞

5、陽性率和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度的檢測(cè)，可做為急性哮喘動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的。
　　 第二部分、IL-23受體對(duì)急性哮喘小鼠脾源性Th17細(xì)胞增殖和致炎機(jī)能的影響
　　 目的：通過檢測(cè)IL-23受體的表達(dá)、Th17細(xì)胞陽性率和IL-17的濃度，探討IL-23受體對(duì)急性哮喘小鼠脾源性Th17細(xì)胞增殖和致炎機(jī)能的影響。
　　 方法：Th17細(xì)胞的陽性率反應(yīng)其

6、增殖情況，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度反應(yīng)Th17細(xì)胞的致炎機(jī)能。免疫磁珠分離的小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞懸于加有胎牛血清的RPMI-1640培基、ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時(shí)，real-time PCR和WB測(cè)定小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞中IL-23受體的表達(dá)，流式儀測(cè)定Th17細(xì)胞的陽性率，ELISA測(cè)定脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度，并分析哮喘組小鼠IL-23受體的表達(dá)和Th17細(xì)胞陽性率、IL-

7、17濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.01)。
　　 (2)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體蛋白的表達(dá)顯著增高(P<0.01)。
　　 (3)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的陽性率顯著增高(P<0.01)。
　　 (4)與正常對(duì)照組

8、相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度顯著增高于(P<0.01)。
　　 (5)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體mRNA的表達(dá)與Th17細(xì)胞的陽性率顯著正相關(guān)(r=0.789，P<0.05)；與IL-17的濃度顯著正相關(guān)(r=0.788，P<0.05)。
　　 (6)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體蛋白的表達(dá)與Th17細(xì)胞的陽性率顯著正相關(guān)(r=0.828，P<0.01

9、)；與IL-17的濃度顯著正相關(guān)(r=0.802，P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體的表達(dá)、Th17細(xì)胞的陽性率和IL-17的濃度均顯著增高。
　　 2.急性哮喘小鼠中IL-23受體的表達(dá)可能影響Th17細(xì)胞的增值和致炎機(jī)能。
　　 第三部分、下調(diào)T-bet表達(dá)通過影響IL-23受體促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖和致炎機(jī)能
　　 目的：通過抑制T-b

10、et的表達(dá)，觀察對(duì)急性哮喘小鼠脾源性Th17細(xì)胞增殖和致炎機(jī)能的影響。
　　 方法：T-bet為觀察對(duì)象，IL-23受體為聯(lián)系T-bet和Th17細(xì)胞的橋梁，Th17細(xì)胞的陽性率反應(yīng)其增殖情況，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度反應(yīng)Th17細(xì)胞的致炎機(jī)能。三對(duì)siRNA-T-bet片斷和陰性對(duì)照，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞后，Western Blot和real-timePCR檢測(cè)T-bet的表達(dá)，篩選出具有最佳沉默效

11、果的片斷，此片斷轉(zhuǎn)染哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞。3組細(xì)胞：正常對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染最佳沉默siRNA片斷哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞，懸于加有胎牛血清的RPMI-1640培基、ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)各組細(xì)胞中T-bet的表達(dá)、IL-23受體的表達(dá)、Th17陽性率和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度，并分析轉(zhuǎn)染最佳沉默siRNA片斷哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-bet的表達(dá)與IL-23受體的表達(dá)、Th17陽性率、I

12、L-17濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)三對(duì)siRNA片斷中以siRNA-T-bet-429沉默效果最為顯著(P<0.01)。
　　 (2)與正常對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-bet mRNA的表達(dá)顯著降低(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-bet mRNA的表達(dá)顯著降

13、低(P<0.01)。
　　 (3)與正常對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-bet蛋白的表達(dá)顯著降低(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-bet蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。
　　 (4)與正常對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-

14、23受體mRNA的表達(dá)顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.01)。
　　 (5)與正常對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中IL-23受體蛋白的表達(dá)顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞

15、中IL-23受體蛋白的表達(dá)顯著增高(P<0.01)。
　　 (6)與正常對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17的陽性率顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17的陽性率顯著增高(P<0.01)。
　　 (7)與正常對(duì)照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源

16、性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度顯著增高(P<0.01)。
　　 (8)轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-betmRNA的表達(dá)與IL-23受體mRNA的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.786，P<0.05)，與Th17陽性率顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.882，P<

17、0.01)，與IL-17的濃度顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.893，P<0.01)。
　　 (9)轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細(xì)胞中T-bet蛋白的表達(dá)與IL-23受體蛋白的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.873，P<0.01)，與Th17陽性率顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.786，P<0.05)，與IL-17的濃度顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.939，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性哮喘中下調(diào)T-