C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)晚期糖基化終產(chǎn)物受體表達(dá)的信號(hào)途徑及其干預(yù)研究.pdf

1、[背景]糖尿病是一種高花費(fèi)、高致殘、高死亡的疾病。其并發(fā)癥已成為主要和日益嚴(yán)重的健康問題。心血管疾病是糖尿病患者致殘、致死，并造成經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。因心血管疾病而死亡的糖尿病患者中，冠心病約占一半。糖尿病動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，繼之對(duì)血管損傷的反應(yīng)提早發(fā)生和加速性動(dòng)脈粥樣硬化是增加冠心病事件及導(dǎo)致死亡的重要原因。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）在內(nèi)皮功能紊亂中發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)多種黏附分子、炎癥因子如細(xì)胞間黏附分子-1（I

2、CAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、E-選擇素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、內(nèi)皮素-1（ET-1）表達(dá)升高。RAGE與配體結(jié)合后促使炎癥細(xì)胞聚集、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖、活性氧自由基（ROS）生成增多，在加速性動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。在糖尿病相關(guān)模型的動(dòng)脈粥樣斑塊中，晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的沉積增高及RAGE表達(dá)升高。給予可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體（sRAGE）后，斑塊面積和復(fù)雜性下降，

3、斑塊變穩(wěn)定。 前期研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)標(biāo)記物C反應(yīng)蛋白（CRP）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在mRNA及蛋白水平表達(dá)RAGE并促進(jìn)MCP-1的過度生成，在加速性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。在生理狀態(tài)下，核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）與其抑制蛋白IκB結(jié)合以無活性的三聚體形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激IκB被降解然后解除對(duì)NF-κB的抑制作用，NF-κB迅速活化進(jìn)入胞核孔體內(nèi)發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。人RAGE基因啟動(dòng)子含2個(gè)NF-κB元件，R

4、AGE下游信號(hào)包括NF-κB，提示RAGE本身存在一個(gè)自我調(diào)控的正反饋回路，當(dāng)RAGE與其配體結(jié)合后激活NF-κB促發(fā)后效應(yīng)同時(shí)，RAGE表達(dá)可以自我上調(diào)。CRP可以通過降解IrB-α使NF-κB活化，故本實(shí)驗(yàn)推測(cè)CRP通過激活NF-κB誘導(dǎo)RAGE的生成，并予以證明。 過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）是核受體超家族成員之一，通過結(jié)合配體活化轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。PPARα激動(dòng)劑是臨床常用治療脂質(zhì)紊亂藥物，具有抗動(dòng)

5、脈粥樣硬化作用。PPARα激動(dòng)劑可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，通過降低E-選擇素，VCAM-1的表達(dá)、抑制ET-1表達(dá)、減少ROS的表達(dá)、增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達(dá)量從而發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣作用。WY14643也稱為匹立尼酸，屬于PPARα配體。研究報(bào)道WY14643可以抑制CRP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的過度表達(dá)。根據(jù)PPAα激動(dòng)劑WY14643的抗炎抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，我們推測(cè)WY14643可能可以抑制CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞

6、生成RAGE和MCP-1。因此目前研究主要目的為探討CRP-RAGE-MCP-1軸的作用機(jī)制及WY14643的干預(yù)作用。 [方法] 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)； 2.利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)WY14643對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RAGE蛋白的影響； 3.利用RT-PCR檢測(cè)WY14643對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RAGE mRNA的影響； 4.利用ELISA法檢測(cè)CRP上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞RAGE的表達(dá)是否通過N

7、F-κB途徑及WY14643對(duì)其影響； 5.利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CRP上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)是非通過NF-κB途徑及WY14643對(duì)其影響； 6.利用RT-PCR檢測(cè)CRP上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)是非通過NF-κB途徑及WY14643對(duì)其影響； 7.利用ELISA方法檢測(cè)CRP上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1是非通過NF-κB途徑及WY14643對(duì)其影響。 [結(jié)果] 1.WY14643對(duì)

8、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RAGE蛋白的影響（流式細(xì)胞技術(shù)） 1）不同濃度WY14643作用內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)對(duì)RAGE蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，加入WY1464310μM即可見RAGE蛋白表達(dá)量下降，在WY14643100μM時(shí)RAGE蛋白表達(dá)抑制更為明顯，WY14643濃度為250μM時(shí)RAGE蛋白表達(dá)量最低。 2）250μM WY14643作用內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)RAGE蛋白表達(dá)的影響WY14643組RAGE蛋白的量均低

9、于對(duì)照組。RAGE蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)6小時(shí)即有下降，并在24小時(shí)達(dá)到最小值。 2.WY14643對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RAGE mRNA的影響（RT-PCR法） 1）不同濃度WY14643作用內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)對(duì)RAGE mRNA表達(dá)的影響加入WY1464310μM即可見RAGE mRNA表達(dá)量有所下降，WY14643100μM對(duì)RAGE mRNA表達(dá)抑制更加明顯，WY14643濃度為250μM時(shí)抑制RAGE mRNA表達(dá)最明顯。

10、 2）250μM WY14643作用內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)RAGE mRNA表達(dá)的影響 將250μM WY14643加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間（6、12、24小時(shí)），發(fā)現(xiàn)WY14643組中目標(biāo)基因PCR產(chǎn)量均低于對(duì)照組。RAGE mRNA表達(dá)量在培養(yǎng)6小時(shí)即有下降，并在24小時(shí)達(dá)到最低值。 3.CRP通過激活NF-κB誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RAGE，并可被WY14643抑制（流式細(xì)胞技術(shù)，RT-PCR法，ELISA法）

11、 1）流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RAGE蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，CRP組RAGE蛋白表達(dá)升高。提前1小時(shí)加入NF-κB拮抗劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）阻斷NF-κB途徑再加CRP作用內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白表達(dá)較CRP組下降。CRP和WY14643共作用組RAGE蛋白表達(dá)較CRP組下降。 2）RT-PCR檢測(cè)RAGEmRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比，CRP組RAGE mRNA表達(dá)升高。CRP與PDTC共作用組RAGE mR

12、NA表達(dá)較CRP組明顯下降。CRP與WY14643共作用組RAGEmRNA表達(dá)較CRP組明顯下降。 3）ELISA檢測(cè)磷酸化NF-κB p65水平 與對(duì)照組比較，CRP組磷酸化NF-κB p65水平升高。CRP與PDTC共作用組及CRP與WY14643共作用組磷酸化NF-κB p65水平較CRP組明顯下降。 4.CRP通過激活NF-κB誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1，并可被WY14643抑制（EUSA法）

13、ELISA檢測(cè)MCP-1表達(dá)：與對(duì)照組比較，CRP組MCP-1水平明顯升高。CRP與PDTC共作用組或與WY14643共作用組MCP-1水平較CRP組明顯下降。 [結(jié)論]本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CRP通過激活NF-κB途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞RAGE和MCP-1的表達(dá)。WY14643可以從蛋白和mRNA水平抑制內(nèi)皮細(xì)胞RAGE的表達(dá)，在一定程度內(nèi)呈濃度-時(shí)間效應(yīng)；并抑制CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞RAGE和MCP-1的表達(dá)，從而阻斷CRP-RAGE-MCP