不同劑量托吡酯對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷腦保護作用的實驗研究.pdf

1、研究背景:缺氧缺血性腦?。℉IE）是新生兒期常見的疾病，是導(dǎo)致新生兒死亡和遠期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的重要因素。由于其發(fā)病機制尚不明確，對其損傷后的治療仍無有力措施。探討發(fā)病機制并在其關(guān)鍵分子上進行有效干預(yù)，對于改善HIE預(yù)后，提高人口質(zhì)量具有重要意義。 托吡酯（TPM），是一種高效新型抗癲癇藥，大量實驗表明其在腦損傷后腦保護中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究表明托吡酯在保護缺氧缺血性腦損傷（HIBD）發(fā)揮著重要的作用，未來有可能用于臨

2、床治療HIBD。但是關(guān)于托吡酯腦保護作用的具體機制、給藥劑量及藥物副作用等目前研究較少。 膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）是TGF-β超家族的一個新亞族成員，發(fā)揮著多效能的神經(jīng)營養(yǎng)作用，并且在改善和促進損傷后的神經(jīng)元修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要作用。腦缺氧缺血可能是腦內(nèi)GDNF分泌增加的啟動因素之一，本課題組前期通過對7日齡的Wistar大鼠研究發(fā)現(xiàn)，HIBD假手術(shù)組偶見GDNF表達；單純?nèi)毖跞毖MGDNF于缺氧缺血后12h開始上

3、升，第2d進一步升高，第3d達高峰，第5d有所回落。 有研究表明，星形膠質(zhì)細胞除了表達Na+和Ca2+通道以外，GluR及GABAR在其細胞膜表明亦有表達，鑒于托吡酯具有抑制Na+或/和Ca2+通道激活以及調(diào)節(jié)腦內(nèi)GluR及GABA平衡之功效。因此，推測托吡酯有可能通過作用于星形膠質(zhì)細胞表達的相應(yīng)受體，達到保護星形膠質(zhì)細胞，促進GDNF的分泌，進而起到保護神經(jīng)元的作用。本課題組的前期研究已證實這一點，研究顯示：不同時間托吡酯給藥

4、后觀察組GDNF的分泌量具有差異性。 本課題組前期研究已證明托吡酯用于HIBD的治療時間窗較短，為缺氧缺血后2h之內(nèi)，且預(yù)防用藥優(yōu)于損傷后用藥；托吡酯的腦保護作用與GDNF的分泌增加有直接關(guān)系。許多動物實驗研究顯示托吡酯對腦缺血有明顯的治療作用，劑量多在50mg/kg-200mg/kg之間，并未產(chǎn)生損傷邊緣系統(tǒng)及影響骨骼發(fā)育等副作用。本課題通過建立HIBD動物模型，借助觀察腦損傷后給予不同劑量托吡酯對腦組織病理學(xué)改變、GDNF動

5、態(tài)表達水平等方面的影響，進一步探討托吡酯腦保護作用的機制、用藥劑量，為托吡酯臨床治療HIE提供強有力的理論和試驗依據(jù)，為HIE的治療開辟一條新的道路。 目的: 1.觀察新生大鼠各處理組相同時間點腦組織的病理學(xué)改變. 2.觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后GDNF表達水平的動態(tài)變化及不同劑量托吡酯干預(yù)對GDNF表達的影響。 3.探討托吡酯腦保護作用的機制。 方法: 1.120只新生7日齡Wist

6、ar大鼠隨機分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖跞毖M及托吡酯治療組，托吡酯治療組根據(jù)不同給藥劑量分為50mg/kg、100mg/kg及150mg/kg治療組. 2.建立HIBD動物模型. 3.給藥及處理方法 （1）托吡酯治療組：將托吡酯溶于注射用水配成2％溶液，采用小型灌胃器灌胃。不同劑量托吡酯治療組分別于手術(shù)前30min給予1次、HIBD模型建成后即刻給予1次、之后每隔12h各一次，直至第5d。 （2）單純?nèi)毖跞毖M和

7、假手術(shù)組同一時間點給予等體積的生理鹽水。 （3）各組均在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分別處死1/4的動物。 4.應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)（Immunocytochemistry）及Western Blotting等試驗方法。觀察和測定研究指標。 結(jié)果: 1.HE染色結(jié)果假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰，細胞輪廓清楚，核居中，尼氏體位于核周邊；單純?nèi)毖跞毖M在缺氧缺血后12h缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體出現(xiàn)輕微的病理

8、變化，第2d病變最嚴重，表現(xiàn)為皮質(zhì)、紋狀體、海馬、丘腦大片壞死區(qū)，第3d病變減輕，出現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生，第5d基本上未見破裂細胞，出現(xiàn)大片膠質(zhì)瘢痕；50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組術(shù)后12h上述部位病變不明顯，第2d出現(xiàn)輕微病變，表現(xiàn)為極少數(shù)細胞間隙增寬，細胞核濃縮，第3d、5d未見明顯病灶；其中150mg/kg托吡酯治療組腦損傷減輕程度較100mg/kg托吡酯治療組明顯，而100mg/kg托吡酯治療組又優(yōu)于5

9、0mg/kg托吡酯治療組，50mg/kg托吡酯治療組較單純?nèi)毖跞毖M腦損傷程度減輕。 2.免疫組織化學(xué)假手術(shù)組僅見較少的GDNF陽性細胞表達，著色較淺，稀疏地分布于整個大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬，雙側(cè)對稱，各時間點上檢測未見明顯的動態(tài)變化；單純?nèi)毖跞毖M和托吡酯各治療組非缺血側(cè)GDNF陽性細胞染色的程度、數(shù)量及變化情況均類似于假手術(shù)組；單純?nèi)毖跞毖M缺血側(cè)皮質(zhì)GDNF陽性細胞在損傷后12h開始表達，第2d進一步上升，第3d達高峰，第

10、5d基本恢復(fù)正常，僅見極少量的GDNF表達；50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組缺血側(cè)皮質(zhì)在損傷后12h即可見較多GDNF表達，第2d進一步增加，第3d達高峰，第5d有所減少，但還可見較多的表達，且150mg/kg托吡酯治療組GDNF的表達尤為明顯，托吡酯治療組在每個時間點上GDNF的表達均明顯高于單純?nèi)毖跞毖M。GDNF的表達增加與托吡酯成劑量正相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.Western blottin

11、g單純?nèi)毖跞毖M與托吡酯各處理組均有GDNF蛋白表達條帶，150mg/kg托吡酯治療組蛋白表達明顯高于單純?nèi)毖跞毖M，100mg/kg托吡酯治療組稍弱，50mg/kg托吡酯治療組較差。應(yīng)用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（Alphaimager2200）掃描定量，通過計算出各組蛋白表達的相對積分值作出蛋白的相對含量，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理發(fā)現(xiàn)：50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組各時間點上蛋白表達均高于單純?nèi)毖跞毖M，有統(tǒng)計學(xué)