白藜蘆醇對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用及其機(jī)制初探.pdf

1、背景：在我國(guó)，糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率和患病率呈現(xiàn)出一個(gè)明顯上升的趨勢(shì)，是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的第二位病因，給人民的健康帶來了嚴(yán)重的威脅。但是，目前對(duì)于DN的治療并沒有很好的辦法，DN仍然具有很高的致死率和致殘率。因此，如何更好地了解DN的發(fā)病機(jī)制及其病理生理變化，從而更好地防治DN，就成為了一個(gè)亟待解決的問題。目前已有不少的研究提示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其2型受體Flk-1(VEGF-Flk-1)系統(tǒng)在DN的發(fā)病過

2、程中具有重要的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用拮抗VEGF-Flk-1系統(tǒng)的藥物也能夠很好地緩解DN的病變。因此，拮抗VEGF-Flk-1系統(tǒng)有可能為DN的治療帶來新的手段和更好的療效。但是，另一方面，目前的拮抗VEGF-Flk-1系統(tǒng)藥物還存在一些比較嚴(yán)重的副作用，很難用于臨床實(shí)踐之中。因此，如何研究和開發(fā)副作用較小的抗VEGF-Flk-1系統(tǒng)藥物，從而更好地防治DN就顯得尤其的重要。白藜蘆醇作為一種天然的植物提取物，其副作用很小，已廣泛地用

3、于人類的生活保健之中。而新近有研究提示，它也有很好的拮抗VEGF的作用，從而應(yīng)用于腫瘤的研究之中。而另一方面，已有不少研究表明，白藜蘆醇能夠通過激活沉默信息調(diào)節(jié)子1(SIRT1)，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有多方面的保護(hù)作用。而近來有研究亦提示，SIRT1本身也具有很強(qiáng)的抑制VEGF表達(dá)的作用。因此，本課題旨在研究白藜蘆醇是否能夠通過激活SIRT1，抑制VEGF-Flk-1系統(tǒng)，而緩解DN的病變，從而為DN的防治提供一個(gè)更好的手段。
　

4、　 方法：(一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：對(duì)SD大鼠予以單腎切除后，使用鏈唑霉素造成1型糖尿病腎病的大鼠模型，隨機(jī)分成對(duì)照組、糖尿病腎病組、以及糖尿病腎病加白藜蘆醇治療組，8周后收集尿及腎臟標(biāo)本。(1)檢測(cè)各組大鼠的體重、血糖、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率、腎重的水平；用過碘酸-雪夫氏染色的方法檢測(cè)各組大鼠腎小球的大小、腎小球內(nèi)基質(zhì)的沉積水平和用透射電鏡檢測(cè)其腎小球基底膜的厚度；以及使用免疫組織化學(xué)術(shù)和Western blot等方法檢測(cè)其腎臟纖維化水平

5、，包括Ⅳ型膠原、纖連蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、纖溶酶原激活物抑制劑-1等的表達(dá)水平。(2)用免疫組織化學(xué)術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟中SIRT1的表達(dá)位置，用Western blot檢測(cè)各組大鼠腎臟內(nèi)VEGF和Flk-1，以及Tie-2和血管生成素-1(Ang-1)的表達(dá)水平，用Real time PCR檢測(cè)各組大鼠腎臟內(nèi)血管生成素-2(Ang-2)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　 (二)體外實(shí)驗(yàn)：(1)體外培養(yǎng)小鼠腎小球足細(xì)胞，

6、分別給予正常糖、高糖、以及高糖加白藜蘆醇干預(yù)，而后使用Western blot、Realtime PCR和ELISA的方法，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)和分泌的變化；并且通過以慢病毒為載體的RNA干擾進(jìn)一步研究SIRT1在其中所起的潛在介導(dǎo)作用。(2)體外培養(yǎng)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，分別給予正常糖、高糖、以及高糖加白藜蘆醇干預(yù)，而后使用Western blot、Realtime PCR的方法，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Flk-1表達(dá)的變化；并且通過以慢病

7、毒為載體的RNA干擾以及轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的方法，進(jìn)一步研究SIRT1在其中所起的潛在介導(dǎo)作用。(3)體外培養(yǎng)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，分成正常對(duì)照組、VEGF刺激組和VEGF加白藜蘆醇干預(yù)組，使用免疫熒光的方法，觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞間細(xì)胞連接的變化；并且通過使用一種體外血管通透性試劑盒，進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞通透性的變化。
　　 結(jié)果：(一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：(1)糖尿病腎病組和白藜蘆醇治療組大鼠的體重和血糖水平無顯著性差異，但較正常組分別有明顯的下降

8、和升高；與正常組大鼠相比，糖尿病腎病大鼠的尿白蛋白排泄率、肌酐清除率、腎重的水平均顯著地增加，而白藜蘆醇治療組則較糖尿病腎病組有明顯的下降；糖尿病腎病組大鼠的腎小球直徑、腎小球系膜基質(zhì)沉積水平、以及腎小球基底膜的厚度均較正常組顯著地增加，而白藜蘆醇治療組則較糖尿病腎病組有明顯的下降；在腎臟纖維化方面，糖尿病腎病組大鼠腎臟內(nèi)Ⅳ型膠原、纖連蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、纖溶酶原激活物抑制劑-1等的表達(dá)水平均較正常組顯著的增加，

9、而白藜蘆醇治療組則較糖尿病腎病組有明顯的下降。(2)在大鼠的腎小球內(nèi)，SIRT1在足細(xì)胞、系膜細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞核中均有較明顯的表達(dá)；VEGF和Flk-1的表達(dá)水平在糖尿病腎病組的大鼠腎臟內(nèi)均明顯的升高，而在白藜蘆醇治療組其腎臟內(nèi)的表達(dá)水平較糖尿病腎病組有顯著的下降；Tie-2的表達(dá)水平在糖尿病腎病組中則明顯的下降，治療組則有所回升，而Ang-1的表達(dá)水平在各組間均無明顯的差異。Ang-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在糖尿病腎病組中明顯升高，而使用

10、白藜蘆醇治療組其Ang-2的轉(zhuǎn)錄較糖尿病腎病組減少。
　　 (二)體外實(shí)驗(yàn)：(1)在培養(yǎng)的腎小球足細(xì)胞中，白藜蘆醇能夠顯著地抑制由高糖刺激引起的足細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)和分泌的升高，并且呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性；而下調(diào)足細(xì)胞內(nèi)SIRTl的表達(dá)后，白藜蘆醇的這種對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用明顯減弱。(2)在培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中，白藜蘆醇能夠顯著地抑制由高糖刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Flk-1表達(dá)的增加，并且呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性；而下調(diào)內(nèi)皮