蛋白酶激活受體2在食管癌細(xì)胞EC109增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用研究.pdf

1、目的:蛋白酶激活受體-2(Proteinase—actived receptors2,PAR-2)是一種細(xì)胞膜表面受體,屬于與G蛋白相耦聯(lián)的蛋白酶激活受體超家族成員,廣泛分布于各個(gè)系統(tǒng)和組織中,可被胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶激活。大量研究表明,PAR-2在多種消化系統(tǒng)腫瘤及其微環(huán)境中都有表達(dá),且強(qiáng)度高于正常組織細(xì)胞,與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一,進(jìn)展較快,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。近期研究表明,PAR-2

2、在食管癌及食管腸上皮化生組織中表達(dá),且其表達(dá)部位主要分布于食管腔內(nèi)。據(jù)此我們推測(cè)PAR-2有可能被消化道反流液中的胰蛋白酶激活參與食管癌的進(jìn)展。然而,目前并無相關(guān)的研究報(bào)道。本研究中我們采用人食管癌細(xì)胞株EC109為靶細(xì)胞,觀察該細(xì)胞中蛋白酶激活受體-2(Proteinase—actived receptors2,PAR-2)的表達(dá)情況；研究內(nèi)源性PAR-2激動(dòng)劑胰蛋白酶和人工PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV對(duì)該細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響；以

3、及胰蛋白酶及PAR-2激動(dòng)肽作用前后MMP-2、MMP-9表達(dá)的改變,探討PAR-2受體介導(dǎo)的食管癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。
　　 方法:1 RT—PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)EC109細(xì)胞中PAR-2mRNA及蛋白的表達(dá)情況。2細(xì)胞生長曲線、MTT法檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽作用前后食管癌細(xì)胞EC109增殖情況。3流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽作用前后細(xì)胞周期改變情況。4 Transwel

4、l小室法檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽作用前后細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。5RT—PCR法檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽作用前后PAR-2、MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)的變化。6明膠酶譜法檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽作用前后MMP-2、MMP-9明膠酶活性的變化。
　　 結(jié)果:
　　 PAR-2在食管癌細(xì)胞EC109中的表達(dá)
　　 1免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示,EC109細(xì)胞與抗PAR-2多克隆抗體有很強(qiáng)的

5、結(jié)合反應(yīng),PAR-2蛋白表現(xiàn)為棕黃色,著色主要在胞膜和胞漿中。
　　 2 RT—PCR檢測(cè)PAR-2的mRNA表達(dá):結(jié)果顯示EC109細(xì)胞在基因水平表達(dá)PAR-2。分別用胰蛋白酶、PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV作用于EC109細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),PAR-2mRNA表達(dá)量分別為(0.781±0.045)、(0.653±0.029),均較對(duì)照組(0.491±0.032)顯著增高(P<0.05),而PAR-2反激動(dòng)肽VKGILS組PAR-2mR

6、NA表達(dá)量為(0.463±0.036),與對(duì)照組(0.46±0.032)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 PAR-2激動(dòng)劑對(duì)食管癌細(xì)胞EC109增殖的影響
　　 1 MTT及細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)檢測(cè)PAR-2激動(dòng)劑(胰蛋白酶和SLIGKV)對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響,其結(jié)果顯示當(dāng)作用時(shí)間相同時(shí),SLIGKV在5—50μmol/L、胰蛋白酶在0.1-10 nmol/L濃度范圍內(nèi)食管癌細(xì)胞的增殖與藥物濃度呈正相關(guān),且呈濃

7、度依賴性。當(dāng)藥物濃度一定時(shí),在1-60 h時(shí)間范圍內(nèi),食管癌細(xì)胞增殖與作用時(shí)間呈正相關(guān),且呈時(shí)間依賴性。而PAR-2反激動(dòng)肽始終對(duì)EC109細(xì)胞增殖無明顯影響。
　　 2流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn):在一定濃度的胰蛋白酶及PAR-2激動(dòng)肽作用下食管癌細(xì)胞EC109的細(xì)胞周期顯著加快,處于G0/G1期細(xì)胞的百分比明顯降低,S期、G2/M期細(xì)胞百分比、細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)明顯增加,與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)。而PAR-2反激動(dòng)肽無此作

8、用。
　　 PAR-2激動(dòng)劑促進(jìn)食管癌細(xì)胞EC109侵襲轉(zhuǎn)移
　　 1 Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)EC109侵襲及遷移能力的變化:在遷移試驗(yàn)中,一定濃度的胰蛋白酶及PAR-2激動(dòng)肽作用后,EC109細(xì)胞經(jīng)變形運(yùn)動(dòng)通過微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組與PAR-2反激動(dòng)肽組(80.8±10.9)(62.6±8.9)vs(41.3±7.2)(45.8±8.5),(P<0.05)。在細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中,藥物作用后EC109細(xì)胞發(fā)揮破

9、壞Matrigel基質(zhì)膠作用,進(jìn)入微孔膜內(nèi)的細(xì)胞數(shù)也顯著高于對(duì)照組(72.5±9.2)(59.4±8.7)vs(31.6±6.6)(36.2±9.8),(P<0.05)。
　　 2 RT—PCR、明膠酶譜檢測(cè)MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)變化:結(jié)果顯示一定濃度的胰蛋白酶及PAR-2激動(dòng)肽作用后細(xì)胞MMP-9mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組及反激動(dòng)肽組(0.719±0.034)(0.466±0.042)vs(0.341±0.03

10、2)(0.370±0.021),(P<0.05),細(xì)胞水解明膠的能力也明顯高于對(duì)照組及反激動(dòng)肽組(75.6±6.1)(60.4±4.6)vs(44.9±4.2)(39.3±5.2),(P<0.05)。而對(duì)MMP-2的mRNA表達(dá)和水解明膠的能力無明顯影響(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1食管癌細(xì)胞EC109在基因及蛋白水平表達(dá)PAR-2受體。并且,PAR-2激動(dòng)劑(胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV)可在基因