以果蠅表達載體系統(tǒng)構(gòu)建可穩(wěn)定表達抗菌性多肽Trappin-2的S2細胞株.pdf

1、目的:Trappin-2為elafin蛋白的前體,又稱pre-elafin和肽酶抑制劑3(peptidase inhibitor3,PI3),屬于trappin家族,在體內(nèi)外環(huán)境中,經(jīng)蛋白酶水解可降解為具有類似生物活性的elafin蛋白。作為一種以黏膜表面分布為主的防御肽,Trappin-2在黏膜表面具有很好的穩(wěn)定性,具有多種生物學功能,能抵抗微生物感染、調(diào)節(jié)炎癥反應、抑制中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,N

2、E)、胰彈性蛋白酶等多種蛋白酶,在肺損傷等疾病中發(fā)揮重要的抗炎作用。近期研究發(fā)現(xiàn)Trappin-2具有佐劑活性,是一種潛在的黏膜佐劑。本研究是利用果蠅S2表達系統(tǒng),構(gòu)建可與S2細胞基因組整合的分別含有Trappin-2和EGFP的重組質(zhì)粒,篩選出兩種抗性穩(wěn)定可表達Trappin-2和EGFP的多克隆S2細胞株,為后期研究Trappin-2黏膜佐劑等生物學活性奠定基礎(chǔ)。
　　方法:首先對pMT/Bip/V5-His A果蠅表達載體進

3、行改造,去掉pMT/Bip/V5-His A的Bip信號肽,改造成為pMT/V5-His A,采用RT-PCR方法從A549細胞中得到含信號肽的、完整的Trappin-2基因,,在引物的5′端引入NotⅠ酶切位點及Kozak序列;引物的3′端引入XhoⅠ酶切位點和雙終止密碼子。利用DNA重組技術(shù)將其定向插入到真核表達載體pMT/V5-HisA中,得到重組表達質(zhì)粒pMT-Trappin-2(簡稱pMT-T2)真核表達載體。為了觀察、比較轉(zhuǎn)

4、染效率和表達水平,我們同時構(gòu)建了帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的載體pMT/V5-His A-EGFP(簡稱pMT/EGFP)。采用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)將鑒定正確的兩種質(zhì)粒pMT-T2和pMT-EGFP分別與抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro(簡稱pro)共轉(zhuǎn)入果蠅S2細胞中,用含有300mg/ml潮霉素B的完全培養(yǎng)基進行篩選,經(jīng)過3-4周,篩選出兩種抗性穩(wěn)定多克隆S2細胞株,用終濃度為500mM的CuSO4誘導表達48h后,分別通過熒光

5、顯微鏡、RT-PCR和Western blot分析目的蛋白在S2細胞中的表達水平。
　　結(jié)果:采用RT-PCR方法從A549細胞中得到Trappin-2基因,通過NotⅠ和XhoⅠ雙酶切位點將Trappin-2克隆入改造好的pMT/V5-His A載體上,構(gòu)建了pMT-T2和pMT-EGFP質(zhì)粒,應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達載體和抗性篩選質(zhì)粒pro共轉(zhuǎn)染果蠅S2細胞,通過潮霉素B反復篩選,約3-4周后,成功篩選到兩種穩(wěn)定的抗性多克

6、隆細胞株,分別命名為S2-Trappin-2和S2-EGFP,用硫酸銅分別誘導兩個細胞株,在熒光顯微鏡下可觀察到S2-EGFP主要表現(xiàn)為胞漿綠色熒光,RT-PCR結(jié)果證實Trappin-2在S2細胞中可穩(wěn)定表達,Western blot分析S2-Trappin-2細胞培養(yǎng)上清可見分子量約10 kDa的特異性條帶,成功建立可穩(wěn)定高表達Trappin-2和EGFP蛋白的果蠅S2細胞系。
　　結(jié)論:成功克隆了Trappin-2基因,并利