β3-AR基因穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建及PPAR-γ2受體對其表達的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：首先構(gòu)建人過氧化物酶體增殖體激活受體γ2(hPPAR-γ2)和人β3腎上腺素受體基因(野生型、突變型)全長cDNA克隆及真核表達載體peDNA3.1(+)/hPPAR-γ2，pcDNA3.1(+)/hβ3-AR；然后將人β3-AR重組表達載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中進行表達；其次在建立的人穩(wěn)定表達細胞系中，研究PPAR-γ2受體對β3-AR表達水平的調(diào)節(jié)。 方法：

2、1．從中國漢族人腎旁脂肪組織提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴增出hPPAR-γ2，hβ3-AR cDNA基因的全長；將RT-PCR產(chǎn)物雙酶切與同樣進行雙酶切的pcDNA3.1(+)載體連接形成重組載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR，pcDNA3.1(+)/hPPAR-γ2。2．用電穿孔法將人hβ3-AR重組表達載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR(突變型和野生型)轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細胞中，用G418篩選獲取陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細

3、胞株，并用RT-PCR、Westem-blot的方法進行鑒定。3．利用構(gòu)建的穩(wěn)定表達人β3-AR的SH-SY5Y的細胞株(本身表達PPAR-γ2受體)，將細胞分為兩組：轉(zhuǎn)染細胞+不加藥，轉(zhuǎn)染細胞+加藥，同時加藥組，給予不同濃度的藥物孵育，觀察細胞在羅格列酮(一種特異性PPAR-γ2激動劑)處理后，β3-AR蛋白表達水平的變化。 結(jié)果：1．從脂肪組織RNA中分別擴增得到1544bp(hβ3-AR)和1578bp(hPPAR-γ2)

4、的目的基因片斷，構(gòu)建了人野生型和突變型的PPAR-γ2、β3-AR的真核表達重組體pcDNA3.1(+)/hPPAR-γ2、pcDNA3.1(+)/hβ3-AR。 2．獲經(jīng)G418抗性篩選后，得到生長良好的單細胞克隆。RT PCR結(jié)果顯示，經(jīng)pcDNA3.1(+)/hβ3-AR轉(zhuǎn)染的G418抗性SH-SY5Y細胞可擴增出的目的條帶；Western-blot結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)/hβ3-AR轉(zhuǎn)染的G418抗性SH-SY

5、5Y細胞有一條約45KD的蛋白條帶，其大小與hβ3-AR相符。 3．轉(zhuǎn)染野生型β3-AR受體的細胞在30μmol/L羅格列酮藥物孵育24h后，β3-AR表達水平明顯下降，而轉(zhuǎn)染突變型β3-AR受體的細胞藥物孵育后，受體表達水平也顯著下降，但兩者間無顯著差異且受體水平的下調(diào)與孵育藥物的濃度相關(guān)。 結(jié)論：本研究克隆了人PPAR-γ2，β3-AR基因全長cDNA并成功構(gòu)建了人野牛型和突變型的PPAR-γ2、β3-AR的真核表達