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文檔簡介
1、人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)是全世界范圍內引起嬰幼兒,老年人、心肺病人及免疫缺陷病人下呼吸道疾病最重要的病原,是一種非分節(jié)段,負鏈RNA包膜病毒,屬于副黏液病毒科。病毒基因組全長15.2kb,共有10個基因,可編碼11種蛋白。其中,黏附蛋白(Glycoprotein,G)為RSV主要中和抗原,基質蛋白(Matrix protein,M)則在病毒的裝配,出芽及病毒顆粒的形成
2、中扮演著重要角色。因此,對RSVG蛋白、M蛋白的大量表達與純化,是Rsv診斷試劑,亞單位疫苗及病毒樣顆粒(VLPs)疫苗研制中需要首要解決的問題。
Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是制備RSV主要蛋白的常規(guī)方法,但存在純化困難及操作繁瑣等問題。而果蠅表達系統(tǒng)(Drosophila expression system)采用簡單的載體及直接的轉染方法,得到穩(wěn)定表達的細胞系,可以較好地彌補桿狀病毒系統(tǒng)的缺陷,同時也能夠生產(chǎn)高表達
3、水平的重組蛋白。
本論文采用果蠅表達載體系統(tǒng),構建了可高效表達RSV G、RSV M的四種S2細胞株。將目的基因通過PCR擴增獲得含信號肽的目的基因,與T載體連接后,轉化大腸桿菌DH5α,并小提質粒,測序,酶切,回收目的基因,將其克隆進果蠅表達載體pMT/V5-His A中,獲得帶有目的基因的重組質粒,酶切后進行凝膠電泳鑒定;大提重組質粒后,將其與抗性篩選質粒pCoHygro共同進行磷酸鈣轉染S2細胞;轉染完成后,采用300μ
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