中藥酚性抗氧化劑清除DPPH自由基機理的推斷性研究.pdf

1、目的:
　　抗氧化劑清除自由基的機理一直存在爭議，目前大部分研究主要停留在理論層面上，為了從化學(xué)實驗的角度提供直接證據(jù)對理論研究成果進行驗證，本課題采用GC-MS和HPLC-MS的方法分析了幾種中藥酚性抗氧化劑與DPPH·自由基反應(yīng)的生成產(chǎn)物，在此基礎(chǔ)上分析此類反應(yīng)可能的機制，系統(tǒng)地研究此類反應(yīng)的一般規(guī)律。
　　方法:
　　本課題從經(jīng)典的DPPH·自由基清除反應(yīng)出發(fā)，用GC-MS和HPLC-MS的方法檢測分析了丁香酚、

2、異丁香酚、香芹酚、麝香草酚、莨菪亭、芥子堿六種天然酚性中藥活性成分以及BHA、BHT兩種人工合成抗氧化劑清除DPPH·自由基后的產(chǎn)物，基于質(zhì)譜結(jié)果，分析推斷該反應(yīng)可能的反應(yīng)機制，并考察了此過程中可能出現(xiàn)的溶劑效應(yīng);為了探索反應(yīng)條件對此類反應(yīng)產(chǎn)物的影響，選取了BHA為代表，分別考察了BHA清除DPPH·自由基過程中，反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)物的摩爾比等因素對反應(yīng)產(chǎn)物類型或反應(yīng)產(chǎn)物峰面積的影響。
　　結(jié)果:
　　GC-MS結(jié)果顯

3、示，BHA與DPPH·自由基反應(yīng)的產(chǎn)物，分子離子峰為m/z358，其中碎片離子109與207出現(xiàn)差值為28的碎片丟失，指示可能生成了中間產(chǎn)物醌或半醌，最終生成了比較穩(wěn)定的二聚體，為RAF機制;BHT與DPPH·自由基反應(yīng)結(jié)果中，檢測到純凈的分子離子峰為m/z430，推測為BHT與DPPH·加成產(chǎn)物，另一新生成的小峰顯示了m/z250分子離子峰，可能發(fā)生了溶劑效應(yīng)。
　　丁香酚與其同分異構(gòu)體異丁香酚清除DPPH自由基的反應(yīng)中，產(chǎn)物均

4、檢測到顯著的分子離子峰m/z326，約為丁香酚或異丁香酚（m/z164）的兩倍，顯示了二聚體的生成，為RAF機制，但只有異丁香酚檢測到另一產(chǎn)物分子離子峰m/z195，同理推測此過程可能伴有溶劑效應(yīng)。
　　另一組同分異構(gòu)體香芹酚和麝香草酚與DPPH·自由基反應(yīng)，質(zhì)譜圖均顯示純凈的分子離子峰m/z298，約為香芹酚或麝香草酚（m/z150）的兩倍，且均伴隨-28的碎片丟失，顯示了中間產(chǎn)物醌或半醌的生成;以上產(chǎn)物的生成過程均發(fā)生了HAT

5、或SET機制，自由基加成過程發(fā)生了RAF機制。
　　HPLC-MS檢測結(jié)果中，莨菪亭與DPPH·自由基反應(yīng)的二維色譜圖中顯示生成了一個新的產(chǎn)物峰(Rt=7.80min)，莨菪亭和反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長分別是351 nm和382nm，顯示了明顯的紅移(351nm→382nm)。HPLC-ESI-MS的分析方法結(jié)果中，產(chǎn)物峰顯示出一個分子離子峰為m/z381.0[M-H]-，提示可能生成了莨菪亭的二聚物，此反應(yīng)過程中，不僅有HAT和S

6、ET機制發(fā)生，也發(fā)生了RAF機制。
　　類似地，芥子堿硫氰酸鹽與DPPH·自由基反應(yīng)結(jié)果也顯示多出一個反應(yīng)產(chǎn)物峰(Rt=7.80min)，芥子堿和反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長分別是344nm和475nm，同樣出現(xiàn)明顯的紅移(344nm→475nm)。HPLC-ESI-MS結(jié)果中，產(chǎn)物峰顯示出一個分子離子峰為m/z703.6[M-H]-，這表明產(chǎn)物可能為芥子堿硫氰酸鹽與DPPH·自由基的加成產(chǎn)物，此反應(yīng)過程，同樣發(fā)生了HAT、SET和RA

7、F機制。
　　BHA與DPPH·自由基反應(yīng)的影響因素考察結(jié)果顯示，在反應(yīng)0.5hr到12hr內(nèi)，隨反應(yīng)時間延長，產(chǎn)物峰面積成緩慢上升趨勢;在20℃到80℃范圍內(nèi)，隨反應(yīng)溫度的升高，產(chǎn)物峰面積反而下降;反應(yīng)物摩爾比考察結(jié)果顯示，BHA與DPPH·摩爾比為1∶1時產(chǎn)物峰面積最大。
　　結(jié)論:
　　1.八種中藥酚性抗氧化劑清除DPPH自由基的反應(yīng)，肯定經(jīng)歷了HAT（氫轉(zhuǎn)移）或SET（電子轉(zhuǎn)移）機制，但具體是HAT還是SET有

8、待進一步確認;
　　2.八種中藥酚性抗氧化劑清除DPPH自由基的反應(yīng)，也肯定經(jīng)歷了RAF機制。RAF機制又分為三種類型，即二聚反應(yīng)、抗氧化劑半醌式自由基與DPPH自由基的加合反應(yīng)、抗氧化劑半醌式自由基與溶劑自由基的加合反應(yīng)（也即溶劑效應(yīng)）。具體是哪一種類型，產(chǎn)物需要綜合考慮到空間位阻、p-π共軛、σ-p超共軛諸多因素而定。本文首次提供了上述三類RAF機制的直接證據(jù)，并提出了相關(guān)的理論分析。
　　3.影響因素考察數(shù)據(jù)顯示，反應(yīng)