制備工藝對(duì)滸苔多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)和降血糖作用的影響.pdf

1、目的：
　　研究不同制備工藝對(duì)滸苔多糖(Enteromorpha’s polysaccharide，EP）初級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；研究滸苔多糖分離純化的條件；研究不同制備工藝所得滸苔多糖降血糖的作用；研究滸苔多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)與其降血糖作用的關(guān)系。
　　方法：
　　1、以福建沿海所產(chǎn)滸苔為實(shí)驗(yàn)材料，分別采用超聲波輔助制備法或纖維素酶法制備滸苔多糖，兩者多糖提取液，均通過離心去渣，通過中性蛋白酶去除蛋白質(zhì)，通過透析袋去除鹽類物質(zhì)，通過

2、DA201樹脂去除色素后，采用醇沉法結(jié)合凍干工藝得到超聲波法制備的滸苔粗多糖UEP（EP by ultrasonic）和纖維素酶法制備的滸苔粗多糖EEP（EP by enyzme）。
　　2、采用DEAE-52纖維素和Sephadex-100凝膠分離純化滸苔粗多糖，得到UEP的主成分UEP1和EEP的主成分EEP1。對(duì)UEP1和EEP1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，用液相色譜分析分子量，用氣相色譜分析單糖組成，用紅外線光譜分析功能團(tuán)；用苯酚硫酸法

3、測(cè)定多糖含量，用硫酸鋇比濁法測(cè)定硫酸根含量，用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量。
　　3、以Hep G2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用胰島素和二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照組，觀察UEP1和EEP1是否能降低葡萄糖。
　　4、建立胰島素抵抗模型，采用二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照組，觀察UEP1和EEP1是否能降低培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖含量，并通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）測(cè)定肝細(xì)胞核因子（HNFs）家族、胰島素受體（IR）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUTs）家族m

4、RNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、滸苔多糖的制備及分離純化
　　UEP和EEP均為淡綠色粉末狀固體，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。水溶性較差，在水中的最大溶解度為40mg/mL。
　　UEP、EEP經(jīng)分離純化，均得到五個(gè)組分，且都以第一個(gè)組分為主成分。UEP五個(gè)組分摩爾比為146：27：40：3：1，主成分UEP1占UEP的67.28％，回收率為98.85%；EEP五個(gè)組分摩爾比為89：18.5：27：

5、8.5：1，主成分EEP1占EEP的61.80%?；厥章蕿?9.12%。
　　UEP1和EEP1均為白色粉末狀固體，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。UEP1、EEP1較UEP、EEP水溶性降低，在水中的最大溶解度為20mg/mL。滸苔多糖水溶液可形成凝膠，且這種溶液——凝膠的轉(zhuǎn)變現(xiàn)象是熱可逆的。
　　2、滸苔多糖結(jié)構(gòu)和成分分析
　　UEP1和EEP1均是α-吡喃型多糖，富含硫酸基團(tuán)，不含蛋白質(zhì)，且含有糖醛酸、羧酸、醚

6、鍵；含有鼠李糖（Rha）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal），以Rha含量最高。
　　但UEP1和EEP1的初級(jí)結(jié)構(gòu)不完全相同。UEP1中Rha、Xyl、Man、Glu、Gal的摩爾比為3.96：1.09：0.24：0.34：0.16；EEP1中 Rha、Xyl、Man、Glu、Gal的摩爾比為3.08：1：0.17：0.30：0.11。UEP1平均分子量為179547，EEP1平均分子量為520

7、160。UEP1多糖含量為98.59%，EEP1為97.09%。UEP1硫酸根含量為17.74%，EEP1為20.71%。UEP1糖醛酸含量為22.20%，EEP1為21.76%。
　　3、不同制備工藝的滸苔多糖降血糖效果及機(jī)制研究
　　Hep G2細(xì)胞葡萄糖消耗試驗(yàn)結(jié)果，與空白組（Blank）比較，陽(yáng)性對(duì)照組1（即胰島素組，Insulin）、陽(yáng)性對(duì)照組2（二甲雙胍組，Metformin）、UEP1由高到低四個(gè)劑量組（HUE

8、P1、MUEP1、LUEP1、SUEP1）、EEP1由高到低四個(gè)劑量組（HEEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1）均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin比較，Blank、LUEP1、SUEP1、SEEP1的葡萄糖消耗量（GC）較低（P＜0.05），Insulin、HEEP1、MEEP1的GC較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Insulin組比較，Blank、Metformin、MUEP1、LUEP1、SUEP1、S

9、EEP1的GC較低（P＜0.05），MEEP1的GC較高（P＜0.05）。比較UEP1降血糖最佳濃度HUEP1與EEP1降血糖最佳濃度MEEP1，發(fā)現(xiàn)MEEP1降血糖效果優(yōu)于HUEP1，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)建立了胰島素抵抗模型，以1×10-3mmol/L胰島素作用36小時(shí)后開始產(chǎn)生胰島素抵抗，60小時(shí)內(nèi)模型穩(wěn)定。油紅O染色可見胰島素抵抗模型鮮紅色脂滴明顯增多。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組Blank比較，模型組（Mo

10、del）、UEP1各劑量組、EEP1各劑量組的GC較低（P＜0.05）；與模型組Model比較，其它組GC均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin比較，Model、HUEP1、MUEP1、LUEP1、SUEP1、LEEP1、SEEP1的GC較低（P＜0.05）。比較UEP1降血糖最佳濃度HUEP1與EEP1降血糖最佳濃度HEEP1，發(fā)現(xiàn)HEEP1降血糖效果優(yōu)于HUEP1，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　觀察U

11、EP1和EEP1各基因的表達(dá)量：①HNF4α：與Blank比較，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較低（P＜0.05）；與模型組Model對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，MUEP1、LUEP1、SUEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達(dá)量較低。②HNF1α：與Blank對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較低（P＜0.05）；與模型組Model對(duì)比，Metformin、HUEP1、MUEP1、HEEP1、MEEP1、L

12、EEP1表達(dá)量較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，MUEP1、LUEP1、SUEP1、LEEP1、SEEP1表達(dá)量較低（P＜0.05）。③HNF1β：與Blank對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較低（P＜0.05）；與模型組Model對(duì)比，Metformin、HUEP1、MUEP1、LUEP1、HEEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達(dá)量較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，MUEP1、LUEP1、

13、SUEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達(dá)量較高（P＜0.05）。④HNF6：與Blank對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較低（P＜0.05）；與模型組Model對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，LUEP1、SUEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達(dá)量較低（P＜0.05）。⑤IR：與Blank對(duì)比，在各實(shí)驗(yàn)劑量組均較低（P＜0.05）；與模型組Model對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較高（P＜0.0

14、5）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，HEEP1表達(dá)量較高，LUEP1、SUEP1、LEEP1、SEEP1表達(dá)量較低（P＜0.05）。⑥GLUT4：與Blank對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較低（P＜0.05）；與模型組Model對(duì)比，實(shí)驗(yàn)劑量組均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，HUEP1、MUEP1、HEEP1表達(dá)量較高（P＜0.05）。⑦GLUT2：與Blank對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組中均較高（P＜0.05）；與模型組

15、Model對(duì)比，各實(shí)驗(yàn)劑量組均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組Metformin對(duì)比，EP各劑量組表達(dá)量均較低（P＜0.05）。
　　比較UEP1和EEP1各基因表達(dá)量：對(duì)比HNF6中UEP1最佳濃度HUEP1與EEP1最佳濃度HEEP1，HUEP1優(yōu)于HEEP1（P＜0.05），對(duì)比IR中UEP1最佳濃度HEEP1與EEP1最佳濃度HUEP1，HEEP1優(yōu)于HUEP1（P＜0.05）。其余HNF4α、HNF1α、HNF1β、G

16、LUT4、GLUT2中UEP1最佳濃度與EEP1最佳濃度差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、兩種不同制備工藝對(duì)滸苔多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)及其降血糖作用均有一定的影響，但其主體結(jié)構(gòu)和主要功能無變化。
　　2、UEP和EEP分離純化后均可分為五個(gè)組分，以第一組分為主。UEP1和EEP1均是α-吡喃型多糖，富含硫酸基團(tuán)，是由不同大小多糖分子組成的混合體。兩者均以Rha為主，還有Xyl、Man、Glu、Gal。但其

17、結(jié)構(gòu)并不完全相同，UEP1平均分子量小于EEP1；UEP1含有Rib、Fuc，而EEP1沒有，且單糖摩爾構(gòu)成比不同；UEP1多糖含量高于EEP1；硫酸根含量低于EEP1；糖醛酸含量高于EEP1。
　　3、采用胰島素1×10-3mmol/L作用于HepG2細(xì)胞36h建立胰島素抵抗模型，經(jīng)油紅O染色鑒定，模型細(xì)胞鮮紅色脂滴增多，正常細(xì)胞僅見少量脂滴。RT-PCR結(jié)果顯示HNFs、IR、GLUT4表達(dá)量下調(diào)，GLUT2表達(dá)量上調(diào)，模型在

18、60h內(nèi)穩(wěn)定，可用于研究藥物對(duì)2型糖尿病的作用。
　　4、UEP1和EEP1均具有降血糖的功效，且作用效果可能優(yōu)于胰島素、二甲雙胍。在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，EEP1降血糖的作用優(yōu)于UEP1，這可能與EEP1的分子量大于UEP1有關(guān)，可能與其能夠更多的上調(diào)胰島素受體的數(shù)目有關(guān)。
　　5、EP改善胰島素抵抗模型可能的機(jī)制有：①通過上調(diào)肝細(xì)胞核因子HNFs的表達(dá)量；②通過上調(diào)IR的表達(dá)量；③通過上調(diào)GLUT4的表達(dá)量；④通過下調(diào)GLUT