IL-12基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗卵巢體內(nèi)外作用的研究.pdf

1、卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤,在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位,其主要特征是腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。目前卵巢癌治療以手術(shù)和放化療為主,但由于卵巢癌早期診斷困難,晚期治療效果差,術(shù)后容易復(fù)發(fā),常規(guī)的治療方法難以明顯提高患者,特別是晚期患者的遠(yuǎn)期生存率,因此,尋找一種新的方法來(lái)改善卵巢癌病人的預(yù)后,提高五年生存率已經(jīng)迫在眉睫,而卵巢癌的生物治療已經(jīng)成為近年來(lái)卵巢癌治療的研究熱點(diǎn)。白細(xì)胞介素12(interleukin-12,IL

2、-12)是目前公認(rèn)的最有效的抗腫瘤細(xì)胞因子之一,利用IL-12重組載體進(jìn)行腫瘤的基因治療極具前景。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)易于外源基因的導(dǎo)入與表達(dá),作為抗腫瘤細(xì)胞基因治療負(fù)載體系極具優(yōu)越性。通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法,將抗腫瘤細(xì)胞因子IL-12轉(zhuǎn)入新型的基因治療有效靶向載體UC-MSCs,為卵巢癌的治療提供了新的途徑。
　　 本研究以UC-MSCs作為

3、基因治療的靶向運(yùn)載工具,構(gòu)建UC-MSCs負(fù)載IL-12重組腺病毒載體(AdIL-12-MSCs),觀察AdIL-12-MSCs對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、體外增殖及凋亡的影響;建立人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3裸鼠移植瘤模型,觀察外源性IL-12對(duì)卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和血管生成的影響,建立小鼠卵巢癌細(xì)胞系OVHM移植瘤模型,觀察外源性IL-12對(duì)卵巢癌OVHM移植瘤的預(yù)防、腫瘤生長(zhǎng)、淋巴管和血管生成的影響,研究化療聯(lián)合基因治療

4、在卵巢癌綜合治療中的療效及UC-MSCs作為抗腫瘤基因治療負(fù)載體系的可行性,進(jìn)一步探討AdIL-12-MSCs抗卵巢癌的作用,為卵巢癌的基因治療提供新靶向。
　　 第一部分 IL-12基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗卵巢癌SKOV3細(xì)胞作用的研究
　　 目的:觀察UC-MSCs和.AdIL-12-MSCs對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、體外增殖及凋亡的影響,探討AdIL-12-MSCs對(duì)卵巢癌的療效,研究UC-MSCs作為基

5、因治療的靶向運(yùn)載工具的可行性。
　　 方法:體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs),以UC-MSCs作為基因治療的靶向運(yùn)載工具,構(gòu)建UC-MSCs負(fù)載IL-12重組腺病毒載體(AdIL-12-MSCs)。采用Western Blotting檢測(cè)AdIL-12-MSCs中IL-12蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)AdIL-12-MSCs中IL-12mRNA的表達(dá),ELISA法檢測(cè)AdIL-12-MSCs上清

6、液中IL-12的表達(dá)。光鏡下觀察UC.MSCs、AdIL-12——MSCs上清液對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)的影響,MTT法檢測(cè)UC-MSCs、AdIL-12-MSCs上清液對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC-MSCs、AdIL-12-MSCs上清液對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、Western Blotting檢測(cè)表明AdIL-12-MSCs組有IL-12蛋白表達(dá)。
　　 2、R

7、T-PCR檢測(cè)表明AdIL-12-MSCs組有IL-12 mRNA表達(dá)。
　　 3、ELISA顯示培養(yǎng)48h后,AdIL-12-MSCs細(xì)胞上清液中IL-12的含量為(79.27±18.36)ng/ml。
　　 4、設(shè)UC-MSCs組、AdIL-12-MSCs組和對(duì)照組SKOV3三組細(xì)胞,光鏡下分別觀察三組細(xì)胞第24h、48h、72h的生長(zhǎng)及形態(tài)。UC-MSCs組和AdIL-12-MSCs組均有抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的作

8、用;與UC-MSCs組相比,AdIL-12-MSCs組抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的作用更加明顯,且抑制作用隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)。
　　 5、MTT法檢測(cè)三組細(xì)胞24、48h、72h體外增殖的情況。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),UC-MSCs組、AdIL-12-MSCs組抑制SKOV3細(xì)胞增殖的能力顯著提高;與UC-MSCs組相比,AdIL-12-MSCs組抑制SKOV3細(xì)胞增殖的作用更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6、

9、流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡情況。UC-MSCs組無(wú)明顯促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用(P＞0.05);AdIL-12-MSCs組SKOV3細(xì)胞的凋亡率為(9.72±1.38)％,與UC-MSCs組SKOV3細(xì)胞的凋亡率(2.69±0.45)％相比,凋亡率顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了AdIL-12-MSCs細(xì)胞系,其分泌的外源性IL-12能夠顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖,促

10、進(jìn)細(xì)胞凋亡;與UC-MSCs相比,AdIL-12-MSCs抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的作用更加明顯,且抑制作用隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng);UC-MSCs作為抗腫瘤基因治療負(fù)載體系具有可行性。
　　 第二部分 IL-12基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤作用的研究
　　 目的:建立人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3裸鼠移植瘤模型,觀察外源性IL-12對(duì)移植瘤生長(zhǎng)和血管生成的影響,研究化療聯(lián)合基因治療在卵巢癌綜合治療中的療效

11、及UC-MSCs作為抗腫瘤基因治療負(fù)載體系的可行性,探討AdIL-12-MSCs抗卵巢癌的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞,建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分為7組,每組8只。荷瘤7天后按組別進(jìn)行尾靜脈移植(5日1次):(1)對(duì)照組:0.2ml PBS;(2)UC-MSCs組:1×106個(gè)UC-MSCs懸浮于0.2ml PBS;(3)Ad-MSCs組:1×106個(gè)Ad-MSCs懸浮于0.2ml PBS;

12、(4)AdIL-12組:109PFU重組IL-12腺病毒懸浮于0.2ml PBS;(5)AdIL-12-MSCs組:1×106個(gè)AdIL-12-MSCs懸浮于0.2ml PBS;(6)環(huán)磷酰胺組:0.2ml PBS尾靜脈移植;環(huán)磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次(自腫瘤接種后第8天);(7)聯(lián)合組(AdIL-12-MSCs+環(huán)磷酰胺):1×106個(gè)AdIL-12-MSCs懸浮于0.2ml PBS尾靜脈移植;環(huán)磷酰胺100mg/kg腹

13、腔注射每周2次;以上各組治療連續(xù)30天。每3天測(cè)量1次皮下移植瘤體的大小,以公式V=πabc/6計(jì)算腫瘤體積(V為體積,a、b、c分別為移植瘤互相垂直的直徑),繪制移植瘤的生長(zhǎng)曲線。計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率,抑瘤率(％)=(a-b)/a×100％(a為對(duì)照組平均瘤重,b為藥物組平均瘤重)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組移植瘤的凋亡率。免疫組化SP法檢測(cè)各組移植瘤組織中IFN-γ、VEGF、CD34的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、人卵

14、巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線:各治療組均能抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),尤其以聯(lián)合組抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用最為明顯。
　　 2、各組移植瘤瘤重和抑瘤率的比較:各治療組的瘤重分別與對(duì)照組相比、AdIL-12-MSCs組與AdIL-12組相比、聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組相比,均有顯著差異(P＜0.05);UC-MSCs組、Ad-MSCs組、AdIL-12組、AdIL-12-MSCs組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組對(duì)SKOV3皮下移植瘤的抑瘤率分別為1

15、4.42％、12.10％、43.81％、59.08％、69.74％、81.84％。
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC-MSCs組、Ad-MSCs組、AdIL-12組、AdIL-12-MSCs組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組移植瘤組織細(xì)胞凋亡率分別為(10.02±0.17)％、(9.76±0.25)％、(14.32±1.08)％、(19.25±1.22)％、(22.56±0.32)％、(30.21±0.56)％。各治療組的凋亡率分別與對(duì)照組相比

16、、AdIL-12-MSCs組與AdIL-12組相比、聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組相比,均有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4、AdIL-12-MSCs對(duì)移植瘤IFN-γ表達(dá)的影響:各組與AdIL-12-MSCs組的HIS比較均有顯著差異(P＜0.05);聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AdIL-12-MSCs對(duì)IFN-γ蛋白的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用。
　　 5、AdIL-12-MSCs對(duì)移植瘤血管生成的影

17、響:各治療組VEGF表達(dá)的HIS和MVD分別與對(duì)照組相比、AdIL-12-MSCs組與AdIL-12組相比、聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組相比,均有顯著差異(P＜0.05)。AdIL-12-MSCs對(duì)移植瘤中VEGF蛋白表達(dá)有明顯抑制作用,使移植瘤血管生成減少。AdIL-1
　　 結(jié)論:AdIL-12-MSCs能夠抑制人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡,其抗腫瘤血管生成作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)IFN-γ的生成,下調(diào)VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)

18、;AdIL-12-MSCs與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用使抑瘤作用增強(qiáng);UC-MSCs作為抗腫瘤基因治療負(fù)載體系具有可行性。
　　 第三部分 IL-12基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗卵巢癌OVHM移植瘤作用的研究
　　 目的:建立小鼠卵巢癌細(xì)胞系OVHM移植瘤模型,觀察外源性IL-12對(duì)卵巢癌OVHM移植瘤的預(yù)防、腫瘤生長(zhǎng)、淋巴管和血管生成的影響,研究化療聯(lián)合基因治療在卵巢癌綜合治療中的療效及UC-MSCs作為抗腫瘤基因治療負(fù)載體系的

19、可行性,進(jìn)一步探討.AdIL-12-MSCs抗卵巢癌的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)鼠卵巢癌OVHM細(xì)胞,建立卵巢癌皮下移植瘤模型,將小鼠隨機(jī)分為8組,每組10只。預(yù)防組將1×106個(gè)AdIL-12-MSC懸浮于0.2ml PBS行腹腔注射,1周后荷瘤,觀察成瘤情況。另外7組于荷瘤7天后,按組別輪流進(jìn)行腹腔注射和尾靜脈移植(5日1次):(1)對(duì)照組:0.2ml PBS;(2)UC-MSCs組:1×106個(gè)UC-MSCs懸浮于0.2

20、ml PBS;(3)Ad-MSCs組:1×106個(gè)Ad-MSCs懸浮于0.2ml PBS;(4)AdIL-12組:109PFU重組IL-12腺病毒懸浮于0.2ml PBS;(5)AdIL-12-MSCs組:1×106個(gè)AdIL-12-MSCs懸浮于0.2ml PBS;(6)環(huán)磷酰胺組:0.2ml PBS尾靜脈移植;環(huán)磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次(自腫瘤接種后第8天);(7)聯(lián)合組(AdIL-12-MSCs+環(huán)磷酰胺):1×10

21、6個(gè)AdIL-12-MSCs懸浮于0.2ml PBS尾靜脈移植;環(huán)磷酰胺100mg/kg腹腔注射每周2次;以上各組治療連續(xù)30天。每3天測(cè)量1次皮下移植瘤體的大小,以公式V=πabc/6計(jì)算腫瘤體積(V為體積,a、b、c分別為移植瘤互相垂直的直徑),繪制移植瘤的生長(zhǎng)曲線。計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率,抑瘤率(％)=(a-b)/a×100％(a為對(duì)照組平均瘤重,b為藥物組平均瘤重)。免疫組化SP法檢測(cè)各組移植瘤組織中CD4+、CD8+、IFN-γ、

22、LYVE-1和CD31的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、卵巢癌OVHM小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線:UC-MSCs和Ad-MSCs不能抑制移植瘤生長(zhǎng),其余各治療組均能抑制移植瘤的生長(zhǎng),尤其以聯(lián)合組抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用最為明顯。
　　 2、各組移植瘤瘤重和抑瘤率的比較:UC-MSCs和Ad-MSCs不能抑制移植瘤生長(zhǎng),其余各治療組的瘤重分別與對(duì)照組相比、AdIL-12-MSCs組與AdIL-12組相比、聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組相

23、比,均有顯著差異(P＜0.05);AdIL-12組、AdIL-12-MSCs組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組對(duì)SKOV3皮下移植瘤的抑瘤率分別為32.34％、58.42％、68.32％、87.79％。
　　 3、治療組小鼠移植瘤組織的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn):AdIL-12-MSCs組和AdIL-12組有較多的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),其余各組腫瘤組織中CD4+和CD8+浸潤(rùn)則明顯減少。
　　 4、AdIL-12-MSCs對(duì)移植瘤淋巴

24、管生成的影響:AdIL-12-MSCs對(duì)LYVE-1蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用,UC-MSCs對(duì)LYVE-1蛋白的表達(dá)可能有促進(jìn)作用,LYVE-1陽(yáng)性表達(dá)的HIS中,各治療組與對(duì)照組相比、AdIL-12-MSCs組與AdIL-12組相比、聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組相比均有顯著差異(P＜0.05)。
　　 5、AdIL-12-MSCs對(duì)移植瘤血管生成的影響:IFN-γ表達(dá)顯示,AdIL-12-MSCs組分別與.AdIL-12組、對(duì)照組相比

25、,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AdIL-12-MSCs對(duì)IFN-γ蛋白的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用。CD31表達(dá)顯示,UC-MSCs和Ad-MSCs不能抑制移植瘤血管生成,而其余各治療組的移植瘤中,CD31表達(dá)HIS顯著降低;AdIL-12-MSCs組與AdIL-12組相比、聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組相比均有顯著差異(P＜0.05)。AdIL-12-MSCs能夠抑制移植瘤血管生成,與化療

26、藥物聯(lián)用可使抑制血管生成作用增強(qiáng)。
　　 6、預(yù)防組小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)、淋巴管及血管生成情況:預(yù)防組有7只小鼠在接種OVHM細(xì)胞后10天左右可見(jiàn)移植瘤形成,腫瘤生長(zhǎng)較為平緩,另外3只未見(jiàn)移植瘤形成,小鼠晚期的體重、飲食、活動(dòng)力及反應(yīng)力無(wú)明顯變化;免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,預(yù)防組移植瘤中CD4+、CD8+及IFN-γ表達(dá)升高,LYVE-1和CD31表達(dá)降低。
　　 結(jié)論:AdIL-12-MSCs能夠抑制卵巢癌OVH