人IL-10基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)異種淋巴細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的有效方法。
　　 2.建立一個(gè)攜帶人白細(xì)胞介素10(hIL-10)的慢病毒載體系統(tǒng)(hIL-10/pLOX-cwGFP),并通過(guò)其介導(dǎo)hIL-10基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。
　　 3.體外驗(yàn)證hIL-10修飾的MSCs(hIL-10-MSCs)抑制異種抗原誘發(fā)的脾淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性增殖及影響脾細(xì)胞分泌的功能,并探討其免疫抑制機(jī)制。

2、r>　　 方法:
　　 1.通過(guò)Fiocll分離法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,體外貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增出MSCs。倒置顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長(zhǎng)特征,CCK-8法定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志CD29、CD34、CD44、CD45的表達(dá),確認(rèn)其分子表型。
　　 2.將hIL-10克隆基因片斷,經(jīng)雙酶切后定向插入到慢病毒載體質(zhì)粒(pLOX-cwGFP)中,慢病毒三質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞,獲得含有h

3、IL-10基因的重組慢病毒,并通過(guò)其來(lái)介導(dǎo)hIL-10修飾豚鼠MSCs。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)hIL-10修飾豚鼠MSCs培養(yǎng)上清液中hIL-10表達(dá)水平。
　　 3.通過(guò)Fiocll分離法分離獲得大鼠和豚鼠的脾淋巴細(xì)胞及大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。CCK-8法測(cè)定MSCs與hIL-10-MSCs對(duì)異種淋巴細(xì)胞增殖的影響。ELISA法測(cè)MSCs與hIL-10-MSCs培養(yǎng)上清液對(duì)大鼠PBMC分泌IFN-γ的

4、影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過(guò)Fiocll分離法和貼壁篩選法結(jié)合,成功分離培養(yǎng)純化擴(kuò)增MSCs。細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,形態(tài)呈梭狀,均勻分布的漩渦狀生長(zhǎng)。傳代周期7d左右,可在體外傳代15代以上,具有強(qiáng)大的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代MSCs表面抗原高表達(dá)CD29、CD44;而低表達(dá)CD34、CD45。
　　 2.經(jīng)基因測(cè)序顯示hIL-10/pLOX-cwGFP中hIL-10序列與基因庫(kù)中hIL-10序列相符合;通

5、過(guò)293T成功包裝出含有hIL-10基因的重組慢病毒;MSCs經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下可見(jiàn)黃綠色熒光。ELISA檢測(cè)hIL-10-MSCs組上清的hIL-10濃度明顯高于MSCs組。
　　 3.MSCs刺激異種脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用弱于淋巴細(xì)胞;MLR顯示,加入hIL-10修飾的和未修飾組的MSCs的淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)均弱于其他組;加入hIL-10-MSCs組的淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)均弱于未修飾組;ELISA檢測(cè)提示hIL-10