磁性siRNA-CCMN沉默Survivin基因?qū)€膀胱癌細胞增殖和凋亡作用的實驗研究.pdf

1、背景與目的:在我國，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，它直接威脅患者的生命。目前，膀胱癌的治療仍以手術(shù)為主，輔以化療、放療、免疫治療等多種方法聯(lián)合治療模式，但是，對于浸潤性和轉(zhuǎn)移性膀胱癌，以上治療方式的遠期療效不盡人意，大多數(shù)患者最終死于腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。所以，探索膀胱癌診斷、治療的新措施、新途徑，提高治療膀胱癌患者的總體生存率，是泌尿外科學者一直關(guān)注、研究的主要焦點。在當代，分子生物學得到日新月異的迅速發(fā)展，研究人員不斷相繼發(fā)現(xiàn)、克隆

2、了一些與膀胱癌相關(guān)的原癌基因、抑癌基因和抗凋亡基因等，這就為探討膀胱癌的發(fā)病機理、研究膀胱癌新的診斷和治療方法提供了新的靶點，使基因治療成為治愈膀胱癌的新希望。
　　 Survivin基因?qū)儆诘蛲鲆种频鞍?IAPs)家族新成員，其分子量最小，結(jié)構(gòu)相對簡單、獨特，與其他IAPs家族成員存在結(jié)構(gòu)上的差別。已有研究表明:Survivin基因具有抑制細胞凋亡，調(diào)節(jié)細胞周期的作用，還有參與新生血管形成等作用。Survivin基因被認為是迄

3、今為止所發(fā)現(xiàn)的所有凋亡抑制因子中抗凋亡作用最強的，它抑制細胞凋亡的作用遠遠強大于IAPs家族中的其他因子。據(jù)文獻報道，Survivin基因?qū)Π螂啄[瘤細胞的發(fā)生發(fā)展起促進作用，并且可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)。由于Survivin基因在大多數(shù)惡性腫瘤組織中選擇性顯著表達，具有強大的抑制腫瘤細胞凋亡的作用，從理論上說，抑制Survivin基因的表達，足以誘導腫瘤細胞明顯的自發(fā)性凋亡，這是其他凋亡抑制基因所不具備的特點。
　　 RNA干

4、擾(RNAi)技術(shù)是最近十年來發(fā)展最快的特異性基因阻斷技術(shù)，它是將具有特定分子結(jié)構(gòu)特點的、長度約19～25nt的雙鏈小RNA(dsRNA)，也叫做小干擾RNA(siRNA)，通過一定的方式導入細胞內(nèi)，然后siRNA特異性的降解與其序列具有同源性的宿主細胞的mRNA，因為降解發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄后階段，因此也叫轉(zhuǎn)錄后水平的目的基因沉默(PTGS)。因為RNA干擾技術(shù)可使靶基因穩(wěn)定沉默，而不影響其他正?；虻谋磉_，并且具有特異性、高效性、簡易性

5、的特點，因此，RNA干擾技術(shù)在用于惡性腫瘤的基因治療方面前景廣闊。
　　 惡性腫瘤的基因靶向治療可以包含兩大方面:首先是靶向目的基因的選擇;二是基因靶向治療方法和策略的選擇。利用與Survivin基因的mRNA序列互補的特異性siRNA作用于有凋亡抵抗的腫瘤細胞，阻斷Survivin基因的表達，為調(diào)控腫瘤細胞凋亡提供了新的治療手段。目前，研究表明，靶向Survivin基因的siRNA干擾可以明顯抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導其凋

6、亡。文獻報道，靶向Survivin基因的siRNA質(zhì)粒能夠明顯誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。但是，目前缺乏能夠驅(qū)動目的基因高效穩(wěn)定表達、安全無害、靶向性高、簡便的新型非病毒型基因?qū)胼d體系統(tǒng)。
　　 隨著現(xiàn)代納米技術(shù)和醫(yī)用高分子材料的發(fā)展，以磁性納米粒子作為基因載體的研究引起廣泛的關(guān)注。磁導向靶向治療是一種最新的抗腫瘤基因靶向治療方法，它是通過具有良好生物相容性和低毒副作用特性的磁性納米粒子載體攜帶目的基因治療分子，在一

7、定強度的外加磁場的作用下，到達病灶靶部位而腫瘤細胞被消滅。羧甲基殼聚糖磁性納米顆粒(CCMN)是國內(nèi)、外目前醫(yī)學領(lǐng)域納米材料研究領(lǐng)域的最新成果，CCMN在外加磁場的作用下，可以引導所負載的物質(zhì)在體內(nèi)做定向移動、定位濃聚，特異選擇性定位，發(fā)揮主動的靶向作用;因此協(xié)同CCMN磁性納米顆粒的磁導向作用，可完成對靶器官、靶細胞甚至到細胞內(nèi)靶結(jié)構(gòu)的選擇性導入。目前，國內(nèi)外尚未見羧甲基殼聚糖磁性納米顆粒(CCMN)系統(tǒng)協(xié)同外磁場用于腫瘤基因靶向治療

8、的報道，鑒于目前腫瘤基因靶向治療中存在的諸多問題和提高靶向治療水平的迫切需要，開展此項研究具有廣闊的前景和很大的臨床應用價值。
　　 本研究采用特異性高的靶向survivin基因的siRNA重組質(zhì)粒(siRNA-survivin)作為負載基因治療分子，以磁性CCMN粒子作為基因載體，并在外磁場的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)染siRNA-survivin入人膀胱癌BIU-87細胞，觀察siRNA對Survivin基因的沉默作用，以及Survivi

9、n基因沉默對膀胱癌絀胞增殖和凋亡的影響，探討磁性siRNA-CCMN納米粒子在膀胱癌基因靶向治療中的作用以及CCMN作為新型非病毒型基因?qū)胼d體系統(tǒng)的可能性。
　　 材料與方法:
　　 1.主要材料
　　 1.1人膀胱癌細胞株BIU-87細胞，為貼壁細胞。
　　 1.2主要儀器設備:超凈工作臺，臺式低溫高速離心機，恒溫CO2培養(yǎng)箱，超低溫冰箱，可調(diào)式脈沖電磁場發(fā)生器頻率50 Hz; H-600型透射電鏡，

10、Zeta粒度分析儀，振動樣品磁信號處理儀，Spectra-30型原子吸收光譜儀，ELX-800酶標儀，PCR儀，GS-800凝膠成像分析儀，DU-800紫外分光光度計。
　　 1.3主要試劑: RPMI-1640培養(yǎng)干粉，OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，羧甲基殼聚糖，聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，多聚賴氨酸(PLL)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒E.I.N.A.TM， RT-PCR試劑盒(TaKaRa RNA PCRk

11、it(AMV)Ver3.0)，總RNA提取試劑盒， Trizol試劑盒， DNA原位末端標記(TUNEL)檢測試劑盒，Western Blotting和ECL發(fā)光試劑盒。
　　 2.方法
　　 2.1Survivin-siRNA干擾序列設計、合成
　　 根據(jù)Reynolds制定的siRNA設計原則，確定目標序列:ACGAGCCAGACTTGGCCCAGT。使用美國Invitrogen公司提供的在線siRNA設計軟

12、件，根據(jù)選定的干擾目標序列設計出相應的shRNA DNA表達模板。經(jīng)BLAST同源性分析后，進行shRNA的DNA模板合成及其與質(zhì)粒載體(pSilencer1.0-U6)的連接、鑒定，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株，命名為pSilencer1.0-siRNA-survivin。
　　 2.2重組質(zhì)粒的擴增、提取
　　 將已轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒的DH5α菌株，接種于含0.05g/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)板上，置于37℃，5％CO2

13、恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取培養(yǎng)板上直徑1mm左右的3個單菌落，溶解于5ml含0.05g/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，將液體培養(yǎng)基在搖床上以＞225rpm的速度振蕩，置于37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日可得到已活化擴增的菌液，用中量去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，按操作說明提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒用DU-800紫外分光光度計檢測質(zhì)粒DNA濃度和純度。
　　 2.3CCMN粒子的制備:采用化學共沉淀法制備CCMN粒子，將1.5g的

14、羧甲基殼聚糖、0.234g的FeCl3·6H2O、0.086g的FeCl2·4H2O一起溶于3 ml水中，一邊用磁力攪拌一邊滴加一定量的氨水，并將溫度迅速升到60℃，反應30 min，然后調(diào)節(jié)pH值到中性，再將聚集物和大粒子低速離心15 min去除后，再使用Sephacryl S-300HR凝膠柱分離并收集凝膠過柱首峰，隨后進行透析充分，冷凍真空干燥即得CCMN。
　　 2.4 siRNA-CCMN粒子的構(gòu)建及理化性質(zhì)檢測:在p

15、H=7時，將PLL、CCMN與pSilencer1.0-siRNA-survivin三者在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中按1∶1∶2的質(zhì)量比混勻振蕩，4℃下放置1h，即可形成siRNA-CCMN，分別用H-600型透射電鏡、粒度分析儀、振動樣品磁信號處理儀和Spectra-30型原子吸收光譜儀分別檢測其直徑、有效粒徑、分散度、比飽和磁化強度、矯頑力及鐵離子含量等。
　　 2.5BIU-87細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:將細胞按每孔1×10

16、5個的數(shù)量，加入含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的6孔板內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長處于對數(shù)期時，用無血清培養(yǎng)液洗滌2次，每孔內(nèi)滴加含2μg siRNA-survivin的siRNA-CCMN粒子。轉(zhuǎn)染6h后加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)操作，同時用熒光顯微鏡檢測細胞轉(zhuǎn)染效率。本實驗設立正常對照組，無磁場作用的siRNA-CCMN組和有磁場作用的siRNA-CCMN組（siRNA-CCMN+

17、磁場）（以下分組和處理均同）。磁場作用組:脈沖電磁場強度為10 mT，按常規(guī)方法進行干預。轉(zhuǎn)染48～72h后收集細胞樣品進行后續(xù)操作。
　　 2.6MTT法檢測對BIU-87細胞增殖的抑制作用
　　 上述3組均設置5個復孔，并設空白對照組。將單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板上，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h，采用MTT法對BIU-87細胞的增殖抑制率進行檢測。取處于對數(shù)生長期的BIU-87絀胞，用不含血清和抗生素的RPMI-

18、1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調(diào)整濃度至1×104個/孔，將ELX-800酶標儀調(diào)于490nm波長處，測定各孔的吸光度值(A)，然后計算各組細胞增殖的抑制率(IR)∶IR=（1-A實驗組/A空白對照組）×100％。
　　 2.7半定量RT-PCR法檢測Survivin基因的mRNA表達水平
　　 轉(zhuǎn)染后48h，常規(guī)消化、收集處于對數(shù)生長期生長良好的各組培養(yǎng)細胞5×104個，按Trizol試劑說明書操作提取總RNA。再用D

19、U-800紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度。隨后按照RT-PCR反應試劑盒的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應合成cDNA，然后進行PCR反應。PCR反應結(jié)束后，對反應產(chǎn)物于4℃進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。標本用GS-800型凝膠成像分析儀進行掃描，再用Doiphin1D軟件進行半定量分析。用Survivin產(chǎn)物的吸光度值(A)與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物的吸光度值(A)的比值表示Survivin基因mRNA的表達強度。Survivin基因的

20、mRNA表達抑制率=（1-實驗組表達強度/空白對照組表達強度）×100％。
　　 2.8TUNEL法檢測BIU-87細胞凋亡
　　 轉(zhuǎn)染后48h，分別消化、收集各組細胞1×106個，制備細胞爬片，用PBS洗滌3次。然后參照TUNEL試劑盒說明書進行操作，結(jié)果判斷:凋亡細胞的細胞核在顯微鏡下觀察，呈棕褐色顆粒狀著色。在顯微鏡下隨機選擇5個視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞，并計數(shù)凋亡細胞占細胞總數(shù)的百分比，即為凋亡

21、指數(shù)(AI)。
　　 2.9Western-Blotting法檢測Survivin基因的蛋白表達強度
　　 轉(zhuǎn)染后72h，分別消化收集各組細胞約2×106個于1.5 ml離心管中，加入冰上預冷1×PBS1ml，洗滌2次，離心1min。棄去上清，加入5倍體積的細胞蛋白裂解液，振蕩混勻，冰浴30min。14000rpm，4℃離心15min。吸取上清至一預冷的EP管中，加入2×SDS上樣緩沖液按1∶4混勻，100℃加熱5min

22、，冷卻，高速離心1min。將變性后的總蛋白100μg經(jīng)10％ SDS-PAGE凝膠電泳。再進行電轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜置于含有封閉緩沖液的平皿中2h。一抗用TBST1∶400(0.2μg/μ1)稀釋，裝入密封袋中，將硝酸纖維素膜放入其中，4℃平緩搖動過夜。再將二抗用TBST1∶1000稀釋，裝入密封袋中。取適當量ECL試劑盒中的A液、B液等體積混合1min，硝酸纖維素膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸5min。將硝

23、酸纖維素膜瀝干，放在包有保鮮膜的薄板上，用GS-800凝膠成像分析儀將膜照相，保存圖像，Quantity One軟件分析條帶像素值，蛋白相對表達量=待測蛋白的光密度值/內(nèi)參的光密度值。
　　 2.10統(tǒng)計學處理
　　 本研究實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理。各組相關(guān)數(shù)據(jù)均以(X)±S來表示，采用單因素方差分析和X2檢驗進行組間數(shù)據(jù)分析比較，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　

24、 1.重組質(zhì)粒siRNA-DNA的濃度和純度
　　 將擴增、提取得到的質(zhì)粒siRNA-DNA通過紫外分光光度計測定其濃度是1.208±0.0045μg/μl，純度是1.890±0.034。所提取的重組質(zhì)粒siRNA-DNA的OD260/OD280比值在1.8～1.9之間，表明重組質(zhì)粒DNA較純，另外重組質(zhì)粒siRNA-DNA的含量在0.8～1.3μg/μl之間，達到細胞轉(zhuǎn)染實驗的要求。
　　 2.siRNA-CCMN粒子

25、的理化性質(zhì):在電鏡下觀察，siRNA-CCMN為圓形，其直徑為10nm～12 nm，分散度為0.34，有效粒徑為94.0 nm，比飽和磁化強度為0.18 emu/g、剩磁、矯頑力分別為0.11 emu/g、2.42，鐵離子含量為340μmol/L。
　　 3.siRNA-CCMN轉(zhuǎn)染效率
　　 siRNA-CCMN轉(zhuǎn)染BIU-87細胞4～6h后，在熒光顯微鏡下，可見較多細胞帶有綠色熒光，siRNA-CCMN+磁場組轉(zhuǎn)染效

26、率為65％左右。
　　 4.siRNA-CCMN對BIU-87細胞增殖的抑制作用
　　 MTT法檢測各組BIU-87細胞轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的增殖抑制率(％)分別是:正常對照組:1.23％，1.66％，1.61％; siRNA-CCMN組:20.54％，27.66％，24.65％;siRNA-CCMN+磁場組:33.62％，44.98％，36.57％。
　　 MTT法檢測的結(jié)果表明，siRNA-CCMN轉(zhuǎn)

27、染BIU-87細胞后，siRNA-CCMN+磁場組的BIU-87細胞增殖水平均顯著低于siRNA-CCMN組和正常對照組(P＜0.05)。siRNA-CCMN組和正常對照組之間的BIU-87細胞增殖水平也存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5.siRNA-CCMN對BIU-87細胞Survivin基因mRNA表達水平的影響
　　 5.1總RNA提取結(jié)果
　　 通過核酸蛋白檢測儀所檢測的各組細胞提取的總RNA的

28、濃度(μg/μl)及純度(OD260/OD280)分別是:正常對照組:0.599，1.912，siRNA-CCMN組:0.663，1.902，siRNA-CCMN+磁場組:0.625，1.895。各組的OD260/OD280的比值在1.8～2之間，表明所提取的總RNA純度較高。
　　 5.2細胞瞬時轉(zhuǎn)染48h后Survivin基因mRNA表達水平
　　 (1)各組細胞瞬時轉(zhuǎn)染48h后，用半定量RT-PCR檢測細胞Surv

29、ivin mRNA表達情況的凝膠電泳圖，未見其他非特異性條帶的出現(xiàn)。第1、2、3泳道分別是siRNA-CCMN組，正常對照組，siRNA-CCMN+磁場組的Survivin及其對應的β-actin擴增條帶。各組在311bp區(qū)域內(nèi)的內(nèi)參照β-actin擴增條帶的亮度相等，說明表達水平無明顯差別;而在587bp處的Survivin擴增條帶，siRNA-CCMN+磁場組條帶亮度明顯弱于其他兩組，說明表達水平有明顯差別。
　　 (2)各

30、組細胞瞬時轉(zhuǎn)染48h后，用半定量TR-PCR檢測細胞Survivin基因mRNA表達的相對水平結(jié)果:正常對照組:0.773， siRNA-CCMN組:0.545，抑制率是32.62％，siRNA-CCMN+磁場組:0.379，抑制率是50.97％。結(jié)果表明，siRNA-CCMN+磁場組BIU-87細胞的Survivin mRNA表達水平分別與正常對照組、siRNA-CCMN組比較，均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其抑制率達

31、50.97％。而siRNA-CCMN組和正常對照組BIU-87細胞的Survivin mRNA表達水平之間也有顯著性差異(P＜0.05)，其抑制率達32.62％。
　　 6.siRNA-CCMN對BIU-87細胞凋亡率的影響
　　 各組BIU-87細胞的凋亡指數(shù)(AI)分別是:正常對照組:2.84，siRNA-CCMN組:13.46，siRNA-CCMN+磁場組:28.40。結(jié)果表明，siRNA-CCMN+磁場組BIU-

32、87細胞的凋亡率明顯高于正常對照組和siRNA-CCMN組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); siRNA-CCMN組也顯著高于正常對照組(P＜0.05)。
　　 7.siRNA-CCMN對BIU-87細胞Survivin蛋白表達的影響
　　 7.1Western Blotting法檢測各組細胞Survivin蛋白的條帶圖，如圖所示，siRNA-CCMN+磁場組條帶灰度明顯變淺，弱于正常對照組和siRNA-CCMN組，提

33、示Survivin的蛋白表達被抑制。
　　 7.2Western Blotting法檢測各組細胞Survivin蛋白的表達強度，結(jié)果分別是:正常對照組:0.874，siRNA-CCMN組:0.475，siRNA-CCMN+磁場組:0.253。結(jié)果表明，siRNA-CCMN+磁場組BIU-87細胞的Survivin蛋白的表達強度明顯低于正常對照組和siRNA-CCMN組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。siRNA-CCMN組也顯

34、著低于正常對照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究采用靶向survivin基因的特異性siRNA重組質(zhì)粒pSilencer1.0-siRNA-survivin作為負載基因治療分子，以CCMN粒子作為基因轉(zhuǎn)染載體，在外磁場的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)染siRNA-survivin入人膀胱癌BIU-87細胞，觀察siRNA-CCMN對Survivin基因的沉默作用，以及Survivin基因沉默對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響，

35、探討磁性siRNA-CCMN納米粒子在膀胱癌基因靶向治療中的作用以及CCMN作為新型非病毒型基因?qū)胼d體的可能性。
　　 2.本研究用化學共沉淀法成功制備了羧甲基殼聚糖氧化鐵磁性納米顆粒(CCMN)，化學共沉淀法制備簡單，反應條件容易控制，制備出來的CCMN具有良好的生物相容性和生物可溶解性、特殊的納米效應、超順磁性、無毒無副作用，在溶液中穩(wěn)定性好，具有較好的具有較好的單分散性?；瘜W修飾后的羧甲基殼聚糖磁性納米顆粒(CCMN)上

36、的高分子羧甲基殼聚糖上的活性基團可通過經(jīng)典的氧化還原反應與pSilencer1.0-siRNA-survivin穩(wěn)定結(jié)合形成siRNA-CCMN，siRNA-CCMN在細胞攝粒作用下可以轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)，而且效率較高，外磁場可以顯著加強轉(zhuǎn)染效率。與現(xiàn)有的載體相比，羧甲基殼聚糖磁性納米顆粒具有安全、特異，可行性好，這為其作為新型基因和藥物納米載體的研究提供了實驗依據(jù)，為腫瘤的磁導向靶向治療奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 3.本實驗結(jié)果顯示，靶向

37、Survivin的siRNA-CCMN成功轉(zhuǎn)染了人膀胱癌細胞株BIU-87細胞后，能夠顯著下調(diào)BIU-87細胞中Survivin基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，明顯誘導BIU-87細胞的凋亡，抑制細胞的增殖，而且在恒定外磁場協(xié)同作用下，siRNA-CCMN的作用顯著加強。說明siRNA-CCMN可以特異、高效地轉(zhuǎn)染膀胱癌BIU-87細胞，并且能有效的發(fā)揮對Survivin基因的RNA干擾作用，為膀胱癌的磁導向基因靶向治療提供了一種可能的