肝靶向免疫基因載體的研究.pdf

1、本研究開發(fā)了一種新型的非病毒基因傳遞系統(tǒng)。通過利用多聚陽(yáng)離子PEI壓縮質(zhì)粒DNA,然后用PEG化的脂質(zhì)體包裹PEI/pDNA壓縮體,形成脂質(zhì)復(fù)合載體LPD,并將人胰島素受體的單克隆抗體(8314-SA)與脂質(zhì)中的DSPE-PEG2000-biotin中的生物素基團(tuán)(biotin)共軛,形成以單克隆抗體(MAb)為靶向基團(tuán)的復(fù)合載體(8314-LPD),MAb提高了復(fù)合載體的靶向能力。8314-LPD是一種肝主動(dòng)靶向四元長(zhǎng)循環(huán)基因載體制劑

2、。其具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 首先用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌擴(kuò)增含有報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA(PEGFP-C1),再用QIAGEN無(wú)內(nèi)毒素大提試劑盒提取質(zhì)粒DNA,并對(duì)其濃度和質(zhì)量進(jìn)行評(píng)定。然后分別制備出PEG化的脂質(zhì)體(脂質(zhì)處方為POPC94％,DDAB2％,DSPE-PEG20003％和DSPE-PEG2000-biotin1％)和PEI/pDNA聚陽(yáng)離子壓縮體,用所得脂質(zhì)體包裹PEI/pDNA壓縮體形成了LPD復(fù)合物。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)

3、合均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化LPD處方,單因素實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果為:質(zhì)粒濃度在40μg/ml以下,粒徑變化不大,濃度增大,復(fù)合物粒徑增大； N/P超過1.5時(shí),質(zhì)粒的包封完全,隨著N/P的增大,復(fù)合物粒徑減小,電位增大,在N/P等于15時(shí),粒徑最小,再增大N/P,粒徑基本不再發(fā)生變化；脂質(zhì)/pDNA的摩爾比在50:1時(shí),酶切電泳顯示脂質(zhì)可以完全包封PEI/pDNA壓縮體,隨著脂質(zhì)/pDNA的比例增大,LPD的粒徑減小,電位降低,在170:1時(shí)粒徑最小,

4、脂質(zhì)/pDNA的摩爾比再增大,復(fù)合物粒徑開始變大。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化LPD復(fù)合物處方的結(jié)果為:在pH7.0的HEPES緩沖液中,質(zhì)粒濃度為40μg/ml,N/P=15,脂質(zhì)/pDNA=170:1時(shí),制備的LPD平均粒徑為130 nm,平均zeta電位為1.5mV。進(jìn)一步對(duì)LPD進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,在外層脂質(zhì)膜的PEG鏈上偶聯(lián)抗人胰島素受體的單克隆抗體(8314-SA),形成肝主動(dòng)靶向的單克隆抗體修飾的Lipo/PEI/pDNA復(fù)合物(8314-

5、LPD)。透射電鏡下觀察,肝靶向8314-LPD復(fù)合物的近似球形,形態(tài)規(guī)整,無(wú)粘連；對(duì)其粒徑電位分析,平均粒徑在150nm左右,電位在4.5mv左右。以綠色熒光蛋白基因PEGFP-C1作為報(bào)告基因考察復(fù)合物對(duì)質(zhì)粒的酶切保護(hù)能力,凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)證明這種基因載體能有效地保護(hù)質(zhì)粒DNA免受DNA酶(DNaseⅠ)降解；血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明8314-LPD復(fù)合物可以在血清中穩(wěn)定存在；長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果,4℃和25℃氮?dú)饷芊赓A存,復(fù)合物粒徑都

6、有所增大,但變化幅度不同,說明溫度對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定性有明顯的作用,25℃貯存會(huì)使復(fù)合物粒徑在一個(gè)月內(nèi)發(fā)生非常大的增大。
　　 體外的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析,LPD載體的轉(zhuǎn)染效率小于PEI/pDNA壓縮體,但是經(jīng)單克隆抗體修飾后,8314-LPD基因載體能夠很好的被人肝癌細(xì)胞SMMC-7721攝取,與前兩組基因載體相比,轉(zhuǎn)染率有明顯的提高。MTT實(shí)驗(yàn)中顯示LPD和8314-LPD復(fù)合物的毒性都明顯小于PEI/pDNA多聚陽(yáng)離

7、子壓縮體。
　　 為了提高8314-LPD復(fù)合物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性,通過冷凍干燥法將其制備成凍干粉針劑。具體步驟是,首先篩選優(yōu)質(zhì)凍干保護(hù)劑,通過考察凍干粉的外觀,色澤,表面細(xì)化程度,再分散能力,發(fā)現(xiàn)海藻糖制備的凍干粉外觀不塌陷,不起泡,色澤均勻,質(zhì)地細(xì)膩；復(fù)溶后,再分散時(shí)間短；復(fù)溶后,復(fù)合物的粒徑和Zeta電位基本沒有變化,是載體的最優(yōu)保護(hù)劑。其次,對(duì)凍干粉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),通過對(duì)凍干粉復(fù)溶后抗酶切實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍干復(fù)溶后的制劑仍能保持抗核

8、酸酶能力,說明載體結(jié)構(gòu)在凍干過程中沒有受到破壞。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明,經(jīng)凍干復(fù)溶的載體的轉(zhuǎn)染活性也基本沒有變化。
　　 本研究結(jié)果表明,8314-LPD復(fù)合物制備方法簡(jiǎn)單易行,能夠有效保護(hù)質(zhì)粒DNA不被核酸酶降解,復(fù)合物的血清中穩(wěn)定性和細(xì)胞轉(zhuǎn)染率都比較高,細(xì)胞毒性小,并可通過冷凍干燥法制備出性質(zhì)穩(wěn)定可長(zhǎng)期保存的凍干粉針劑。這種肝主動(dòng)靶向的長(zhǎng)循環(huán)免疫基因載體,綜合利用了陽(yáng)離子多聚物和脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn),克服了二者的缺點(diǎn),相信在肝癌的基因治療中,