二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)對卵巢透明細(xì)胞癌的影響.pdf

1、卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌占原發(fā)性卵巢腫瘤50％～70％，目前認(rèn)為上皮來源的卵巢癌是由一組不同形態(tài)及不同分子遺傳特性的獨(dú)立疾病所構(gòu)成的一類腫瘤。透明細(xì)胞瘤是上皮性卵巢腫瘤中的一種，在東方女性中較西方更為常見。和其它類型的上皮性卵巢癌相比，透明細(xì)胞瘤大部分為惡性腫瘤，預(yù)后不佳，并且對化療不敏感。故此，將卵巢透明細(xì)胞腫瘤當(dāng)做一類獨(dú)立腫瘤進(jìn)行相關(guān)研究具有必要性。
　　EPA(二十碳五烯酸)屬于n-3

2、多元不飽和脂肪酸，雖然人體內(nèi)可以通過亞麻酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)少量的EPA，但是人體所需EPA大部分仍然從食物中獲取。一些學(xué)者對比了某些種類癌癥患者和正常人血漿中的EPA的含量，發(fā)現(xiàn)前者血漿中EPA的含量明顯低于正常人血漿，這一臨床現(xiàn)象提示了EPA對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著某些作用。目前，在癌癥惡病質(zhì)患者中，攝入EPA可以維持和增加惡病質(zhì)患者的體重，并且也能增加化療敏感性。卵巢透明細(xì)胞癌由于其惡性程度高和對化療不敏感，由此我們思考EPA是否也能影響卵巢透

3、明細(xì)胞癌，目前在所有EPA和腫瘤的研究中，還沒有研究證實(shí)過EPA和卵巢透明細(xì)胞癌的關(guān)系。
　　在本實(shí)驗(yàn)研究中，通過對卵巢透明細(xì)胞系ES2的研究，證實(shí)了EPA可以有效抑制ES2的增殖，促進(jìn)其凋亡。進(jìn)而，本實(shí)驗(yàn)尋求了EPA影響卵巢透明細(xì)胞癌的相關(guān)機(jī)制。在近年研究中，脂肪酸可通過一系列的G蛋白偶聯(lián)受體實(shí)現(xiàn)其各種生物學(xué)效應(yīng)，包括對細(xì)胞膜的形成、膜受體的組成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因轉(zhuǎn)錄和炎癥等方面，這一類G蛋白偶聯(lián)受體也被稱為脂肪酸受體(fre

4、e fatty acid receptor，F(xiàn)FAR)。不同的FFAR對不同碳鏈長度脂肪酸的識別具有特異，例如FFAR1(GPR40)和GPR120是目前已報(bào)道的可以識別長鏈不飽和脂肪酸的FFAR，它們的Gα亞基均為Gαq/11。我們首先猜測GPR40和GPR120是否在ES2細(xì)胞中介導(dǎo)EPA的生物學(xué)效應(yīng)，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)ES2中GPR120和GPR40的表達(dá)量非常低，并且無法檢測到Gα亞基激活后可引起的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度上升。所以，我們探

5、尋是否存在其它的G蛋白偶聯(lián)受體可以在ES2細(xì)胞中介導(dǎo)EPA作用。
　　GPR30是近年報(bào)道的一種新的雌激素受體，主要介導(dǎo)雌激素的快速非基因組效應(yīng)，其α亞基為Gs，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。GPR30和傳統(tǒng)雌激素受體ERα、β沒有同源性，但是其配體種類大致相同。其對17βE2產(chǎn)生3～6nM親和力，但對17αE2、雌酮和雌三醇的親和力非常低，而對孕酮、皮質(zhì)醇和睪酮幾乎沒有結(jié)合力。此外，一些合成的抗雌激素藥物中，例如他莫昔芬和氟維司群(ICI

6、182780)，以及一些植物類雌激素，例如大豆，也均為GPR30的配體。當(dāng)GPR30的配合和其結(jié)合之后，偶聯(lián)的G蛋白被激活，分離為Gα和Gβγ異二聚體。Gβγ異二聚體可以激活Src和AC，前者可以通過一些列反應(yīng)激活細(xì)胞膜上得EGFR受體，后者可以引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度上升，從而產(chǎn)生下游生物學(xué)效應(yīng)。關(guān)于GPR30在組織學(xué)中的表達(dá)，其可在正常的乳腺、卵巢、子宮等組織中表達(dá)，也可在一些病理組織中表達(dá)，例如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、甲狀腺癌、

7、前列腺癌和肺癌。其中，在卵巢癌中，GPR30的表達(dá)量和其預(yù)后相關(guān)。目前，關(guān)于GPR30所能引起的分子生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制的研究仍然很欠缺，在本文中，首次證明了EPA可以作為GPR30的配體，并且在ES2細(xì)胞中，EPA通過GPR30產(chǎn)生其各項(xiàng)生物學(xué)效應(yīng)。
　　第一部分 EPA在體外影響卵巢透明細(xì)胞癌生長
　　目的:在體外條件下，從細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡兩方面，進(jìn)行EPA對卵巢透明癌細(xì)胞系ES2影響的評估。
　　方法:在不同濃度

8、(0-300uM)不同種類（棕櫚酸、棕桐油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、亞麻酸、二十碳五烯酸）的脂肪酸處理下，使用CellTiter96? AqueousNon-Radioactive試劑盒測試ES2細(xì)胞增殖;為排除脂肪酸對細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性而抑制細(xì)胞生長，使用CCK-8細(xì)胞毒性測試對不同濃度不同種類脂肪酸加入ES2后進(jìn)行檢測，選擇本實(shí)驗(yàn)所用的脂肪酸實(shí)驗(yàn)濃度;在實(shí)驗(yàn)濃度下，不同脂肪酸在不同時(shí)間內(nèi)對ES2細(xì)胞增殖的影響;使用流式細(xì)胞儀檢測加入

9、EPA后ES2細(xì)胞凋亡的改變;使用RT-PCR檢測加入EPA后ES2中促凋亡基因（bax、bim、puma）及抑凋亡基因(bcl-2, bcl-xl，survivin)的mRNA含量改變。
　　結(jié)果:EPA在300uM的濃度下不會對ES2細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性。EPA對ES2細(xì)胞增殖具有劑量效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng);EPA可以促進(jìn)ES2細(xì)胞凋亡，并且促進(jìn)促凋亡基因表達(dá)（bax、bim、puma），降低抑凋亡基因表達(dá)(bcl-2, bcl-xl，su

10、rvivin)。
　　結(jié)論:EPA在體外可以影響卵巢透明細(xì)胞癌的生長，具體表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 EPA通過GPR30影響卵巢透明細(xì)胞癌生長
　　目的:探求ES2中介導(dǎo)EPA主要生物學(xué)功能的受體。
　　方法:在加入Gq抑制劑Ym25486或不加的條件下，驗(yàn)證EPA和PAL已發(fā)現(xiàn)的受體GPR40和GPR120的下游效應(yīng)，即細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升。此外，加入Ym25486后檢測EPA對ES2的

11、抑制增殖和促進(jìn)凋亡效應(yīng)是否有改變。使用RT-PCR檢測已報(bào)道的各類脂肪酸受體和GPR30在ES2中的mRNA表達(dá)。利用脂肪酸一蛋白結(jié)合試驗(yàn)確定在ES2細(xì)胞中EPA是否可以直接結(jié)合于GPR30。通過siRNA和加入GPR30抑制劑G15的方法，探求GPR30是否為ES2中主要介導(dǎo)EPA作用的受體。通過western blot、cAMP濃度檢測、RT-PCR方法驗(yàn)證EPA激活GPR30后的下游途徑。
　　結(jié)果:未加入Ym25486時(shí)，

12、EPA引起ES2中1.5倍的鈣離子濃度改變，作為對比，PAL引起ES2中4倍的鈣離子濃度改變。加入Ym25486后，EPA引起的ES2中鈣離子濃度變化不因Ym25486而改變，作為對比，PAL引起的ES2中鈣離子濃度上升收到Y(jié)m25486的抑制。相應(yīng)地，Ym25486不影響EPA對ES2產(chǎn)生的抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。GPR30在ES2中的表達(dá)量比其余已報(bào)道的脂肪酸受體明顯高。并且在ES2細(xì)胞中，EPA可以直接識別GPR30。通

13、過siRNA干擾GPR30表達(dá)或者加入GPR30抑制劑G15后，EPA對ES2產(chǎn)生的抑制增殖和促進(jìn)凋亡效應(yīng)均有明顯恢復(fù)。EPA可以通過GPR30引起ES2中ERK和Akt磷酸化水平下降，并且引起cAMP濃度上升進(jìn)而活化蛋白激酶A。
　　結(jié)論:已發(fā)現(xiàn)的長鏈脂肪酸受體GPR40和GPR120不是介導(dǎo)EPA在ES2中產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的受體。GPR30可以作為EPA的受體，并且介導(dǎo)EPA在ES2中抑制增殖和促進(jìn)凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。
　　

14、第三部分 EPA在體內(nèi)通過GPR30影響卵巢透明細(xì)胞癌生長
　　目的:驗(yàn)證在體內(nèi)，EPA是否通過GPR30影響卵巢透明細(xì)胞癌ES2的生長。
　　方法:使用BALC/C雌性裸鼠構(gòu)建ES2細(xì)胞皮下瘤模型。于裸鼠右側(cè)腋部皮下2*106/200ul/只接種，每日觀察裸鼠成瘤情況。將成瘤小鼠隨機(jī)分為四組，NC組、NC+EPA組、shRNA組和口shRNA+EPA組，其中shRNA組和口shRNA+EPA組小鼠的皮下瘤通過shRNA干擾

15、了ES2中GPR30表達(dá)。第五日開始進(jìn)行EPA瘤周注射處理，NC+EPA組和siGPR30+EPA組中，每隔2日給予EPA300uM200ul局部瘤周皮下注射。于第14日解剖皮下瘤，測量腫瘤體積及重量，并進(jìn)行免疫組化檢測。
　　結(jié)果:第4日皮下可見類圓形腫塊，直徑約5mm。加入EPA處理后，裸鼠所荷腫瘤明顯縮小。對比shRNA組和shRNA+EPA組，在干擾了GPR30表達(dá)之后，加入EPA后腫瘤大小沒有明顯變化。免疫組化結(jié)果提示，