薄片法血小板快速凝集實(shí)驗(yàn)的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、迄今為止沒(méi)有可供臨床常規(guī)應(yīng)用的血小板功能檢測(cè)技術(shù)，國(guó)內(nèi)外血液中心僅通過(guò)詢問(wèn)和捐血者問(wèn)卷措施減少血小板功能缺陷的捐血者。血小板輸注無(wú)效的臨床發(fā)生率高達(dá)15％～40％，尚未見(jiàn)血小板制劑質(zhì)量或（和）功能缺陷因素占血小板輸注無(wú)效原因的統(tǒng)計(jì)報(bào)道。急需建立便捷、快速、價(jià)廉的血小板功能檢測(cè)技術(shù)用于街頭、獻(xiàn)血屋和血站血小板捐血者的快速篩查。本研究探索以新型血小板激活劑--焦性沒(méi)食子酸丙酯陽(yáng)離子鹽溶液（Cationic propyl gallate，c-

2、PG）建立薄片法血小板凝集時(shí)間（Slide Platelet Clot Time，SPCT），并初步應(yīng)用于捐血人群、服用抗血小板藥物患者、血小板減少癥患者和各種血小板制品的快速篩查。
　　 第一部分 焦性沒(méi)食子酸丙酯陽(yáng)離子溶液與SPCT的建立
　　 該部分主要通過(guò)選擇的c-PG濃度、比較常用血小板激活劑誘導(dǎo)血小板凝集的可視性、檢測(cè)血小板抑制劑對(duì)c-PG誘導(dǎo)的SPCT影響以及c-PG誘導(dǎo)的SPCT影響因素，優(yōu)化建立SPCT

3、。
　　 第一節(jié) c-PG濃度對(duì)其誘導(dǎo)的SPCT凝集時(shí)間的影響
　　 目的：篩選c-PG的合適濃度。方法：隨機(jī)選取健康捐血者富含血小板血漿（PRP）8份，分別以終濃度為20gM、30gM、40gM和50gM的c-PG誘導(dǎo)SPCT。結(jié)論：隨著c-PG濃度的增加，血小板開(kāi)始發(fā)生凝集和形成明顯的肉眼可見(jiàn)凝塊的時(shí)間快速縮短，本研究選擇c-PG終濃度為40μM應(yīng)用于SPCT。
　　 第二節(jié) c-PG與常用血小板激活劑誘導(dǎo)的

4、SPCT凝集強(qiáng)度和時(shí)間的比較
　　 目的：為SPCT選擇可視性好的血小板激活劑。
　　 結(jié)論： c-PG誘導(dǎo)PRP的凝塊最大，SPCT時(shí)間較短，結(jié)果更易于判定。
　　 第三節(jié) 血小板抑制劑對(duì)c-PG與常用血小板激活劑誘導(dǎo)的SPCT影響的比較
　　 目的：比較c-PG與常用血小板激活劑誘導(dǎo)的SPCT檢測(cè)血小板抑制劑的能力。結(jié)論：c-PG、瑞斯托霉素和AA均能檢測(cè)出PGI2、cAMP、EDTA和DMSO對(duì)血小

5、板的抑制作用。
　　 第四節(jié) c-PG、ADP和花生四烯酸誘導(dǎo)的SPOT檢測(cè)志愿者服用阿司匹林前后血小板功能變化
　　 目的：比較c-PG、ADP和AA誘導(dǎo)的SPCT檢測(cè)健康志愿者服用阿司匹林前后血小板功能變化的能力。結(jié)論：以40μM c-PG或500μg/mlAA為誘導(dǎo)劑的SPCT，均可高效檢測(cè)出服用阿司匹林后患者血小板功能的顯著變化。
　　 第五節(jié) 肝素和枸櫞酸鹽對(duì)c-PG誘導(dǎo)的SPOT的影響
　　

6、目的：檢測(cè)肝素和枸櫞酸鹽對(duì)c-PG誘導(dǎo)的SPCT的影響。結(jié)論：添加肝素和明顯增加枸櫞酸鹽濃度對(duì)c-PG誘導(dǎo)的SPCT無(wú)明顯影響。
　　 第六節(jié) c-PG溶液4℃冰箱儲(chǔ)存3年的穩(wěn)定性研究
　　 目的：檢測(cè)c-PG溶液儲(chǔ)存3年的穩(wěn)定性。結(jié)論：4℃儲(chǔ)存三年對(duì)c-PG溶液誘導(dǎo)的血小板凝集時(shí)間無(wú)明顯影響，c-PG具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
　　 第七節(jié) 血小板計(jì)數(shù)和溫度對(duì)cPG誘導(dǎo)的SPCT影響
　　 目的：研究血小板

7、計(jì)數(shù)和溫度對(duì)cPG誘導(dǎo)的SPCT影響。結(jié)論：（1）血小板計(jì)數(shù)與SPCT有明顯的線性負(fù)相關(guān)。（2）20℃～40℃對(duì)SPCT無(wú)明顯影響；而溫度≤10℃時(shí)SPCT明顯延長(zhǎng)。（3）室溫放置4小時(shí)對(duì)SPCT無(wú)明顯影響。
　　 第二部分 c-PG誘導(dǎo)的SPCT在捐血人群、患者和血小板制劑中的應(yīng)用
　　 本研究測(cè)定全血捐獻(xiàn)者和單采血小板捐獻(xiàn)者、服用抗血小板藥物的心內(nèi)科患者、化療致血小板減少癥患者、單采血小板、濃縮血小板和深低溫保存血小

8、板的SPCT，探索其SPCT的主要特征。并模擬血小板輸注的體外模擬混合SPCT，探索血小板輸注無(wú)效的輸血前篩查新方法。
　　 第一節(jié).全血捐獻(xiàn)者和單采血小板捐獻(xiàn)者的SPCT
　　 目的：測(cè)定全血捐獻(xiàn)者和單采血小板捐獻(xiàn)者SPCT。方法：隨機(jī)選取267名全血捐獻(xiàn)者和相對(duì)固定的單采血小板的捐血者84人次，分離PRP測(cè)定SPCT。結(jié)果：267份全血捐獻(xiàn)者和84份血小板捐獻(xiàn)者SPCT分別為73s±21s（最大值216s，最小值為4

9、1s）和72s±22s（最大值234s，最小值為38s），兩組無(wú)顯著差異（p>0.05）；8例SPCT大于180秒，占2.5％。結(jié)論：351份全血或血小板捐獻(xiàn)者SPCT平均值為73s，最大值234s，最小值為38s，血小板功能不良率為2.5％。
　　 第二節(jié) 服用抗血小板藥物的心內(nèi)科患者
　　 目的：測(cè)定服用抗血小板藥物治療的心內(nèi)科患者SPCT。方法：選取患有不穩(wěn)定性心絞痛和冠心病的服用抗血小板藥物的心內(nèi)科住院患者65例

10、，測(cè)定SPCT。結(jié)果：65例患者化療后患者的SPCT均大于300秒。結(jié)論：40μM的c-PG不能誘導(dǎo)服用抗血小板藥物連續(xù)超過(guò)3天患者的血小板在玻片上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集。
　　 第三節(jié) 化療后血小板嚴(yán)重減少患者
　　 目的：測(cè)定化療后血小板嚴(yán)重減少患者SPCT。方法：選取血液科預(yù)約輸注血小板治療的化療后血小板嚴(yán)重減少癥患者34例，測(cè)定SPCT。結(jié)果：出現(xiàn)凝集標(biāo)本5例（其中小于180秒者3例），其余29例（85.3％）在超過(guò)

11、300秒的計(jì)時(shí)內(nèi)均未凝集。結(jié)論：當(dāng)臨床醫(yī)生為化療患者申請(qǐng)血小板輸注治療時(shí)，患者外周血血小板計(jì)數(shù)往往已經(jīng)極度降低（多數(shù)患者<20×109/L），這時(shí)患者多數(shù)不適合采用SPCT檢測(cè)其血小板功能。
　　 第四節(jié) 22℃液態(tài)振蕩保存單采血小板和濃縮血小板的SPCT
　　 目的：測(cè)定單采血小板和濃縮血小板的SPCT。方法：1）隨機(jī)選取單采血小板90份，測(cè)定濃度為200×109/L、100×109/L、50×109/L、25×109

12、/L、12.5×109/L時(shí)的SPCT；2）隨機(jī)選取10份濃縮血小板，測(cè)定濃度為100×109/L、50×109/L、25×109/L、12.5×109/L時(shí)的SPCT。結(jié)果：1）單采血小板濃度為200×109/L、100×109/L、50×109/L、25×109/L、12.5×109/L時(shí)的SPCT分別為32s±7s、53s±14s、96s±29s、185s±50s；100例單采血小板中1例在計(jì)數(shù)為50×109/L時(shí)即不凝集，占1.

13、0％；血小板計(jì)數(shù)為25×109/L時(shí)，SPCT為184s±49s，（中位數(shù)180s，最小值102s，最大值298s），其中大于180s者49例（49.5％）；血小板計(jì)數(shù)為12.5×109/L時(shí)，凝集時(shí)間大于180s者16例（16.2％），不凝集81例（81.8％）。2）10袋手工分濃縮血小板當(dāng)計(jì)數(shù)為50×109L時(shí)，SPCT為95s±31s（中位數(shù)99.5s，最小值50s，最大值142s）：計(jì)數(shù)為25×109/L時(shí)，SPCT為179s±

14、58s（中位數(shù)169.5s，最小值118s，最大值281s），其中大于180s者4例（40％）；血小板計(jì)數(shù)為12.5×109/L時(shí)凝集時(shí)間大于180s 10例（100％），其中有5例不凝集（50％）。結(jié)論：血小板計(jì)數(shù)為50×109/L時(shí)，不出現(xiàn)凝集的單采血小板占1％，PC均出現(xiàn)凝集：血小板計(jì)數(shù)為25×109/L時(shí)，單采血小板SPCT大于180秒的占49.5％，PC為40％；血小板計(jì)數(shù)為12.5×109/L時(shí)，單采血小板SPCT大于180

15、秒的占98％，PC為100％。
　　 第五節(jié) 冰凍富含血小板血漿
　　 目的：測(cè)定冰凍PRP的SPCT。方法：隨機(jī)選取40份健康捐血者的PRP，測(cè)定FPRP、DMSO-PRP和Cryo-PRP的SPCT。結(jié)果：FPRP、DMSO-PRP和Cryo-PRP的SPCT分別為59s±14s、108s±17s、115s±19s。與FPRP比較，DMSO-PRP和Cryo-PRP SPCT均發(fā)生了顯著變化（p<0.001）；DMS

16、O-PRP和Cryo-PRP比較SPCT也發(fā)生明顯變化（p<0.005）。結(jié)論：由于含有5％DMSO并經(jīng)過(guò)冰凍降溫和復(fù)溫過(guò)程，冰凍PRP的SPCT較FPRP比較顯著的延長(zhǎng)。
　　 第六節(jié) 血小板輸注有效性體外模擬混合SPCT實(shí)驗(yàn)
　　 目的：體外模擬血小板輸注的混合SPCT實(shí)驗(yàn)。方法：隨機(jī)選取申請(qǐng)血小板輸注的血小板極度減少的血液科患者18例，分離患者PRP按照患者總血容量與所輸機(jī)采血小板體積比混合，測(cè)定混合后的SPCT。