外源p204對(duì)斑馬魚先天免疫的影響和p204轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建.pdf

1、天然免疫和適應(yīng)性免疫共同組成了動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。天然免疫是機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線，在天然免疫系統(tǒng)中最重要的一環(huán)就是模式識(shí)別受體PRRs對(duì)病原微生物模式相關(guān)分子PAMPs的識(shí)別。TLR是重要的胞外和胞內(nèi)受體，參與到NF-κB和IRF激活的信號(hào)通路，引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)。天然免疫和適應(yīng)性免疫不是獨(dú)立的兩個(gè)系統(tǒng)，相反，天然免疫的重要分子和信號(hào)通路可以激活適應(yīng)性免疫。在這個(gè)機(jī)制中，TLRs信號(hào)通路是聯(lián)系天然免疫與適應(yīng)性免疫的

2、紐帶。
　　 斑馬魚與人類一樣具有天然免疫和適應(yīng)性免疫。對(duì)斑馬魚適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的研究已有多年，取得了重要的研究成果，研究技術(shù)也有很大的提高。然而，對(duì)斑馬魚天然免疫系統(tǒng)的研究才剛剛起步。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原微生物感染的第一道防線，而且對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活有重要的影響。因此在斑馬魚中深入研究天然免疫系統(tǒng)不僅可以促進(jìn)我們對(duì)斑馬魚自身的免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，而且從進(jìn)化的角度看，也為研究高等脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)提供思路和工具。并且斑馬魚因其

3、個(gè)體小、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、易繁殖和繁殖率高、胚胎透明易觀察、便于胚胎操作等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能的相關(guān)研究。
　　 本研究以斑馬魚為動(dòng)物模型，采用顯微注射的方式將外源的p204質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，通過觀察報(bào)告基因GFP的熒光表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p204在斑馬魚胚胎中從8hpf開始表達(dá)，表達(dá)位置主要集中在斑馬魚的胸腹部，在8hpf-8dpf時(shí)期p204大量表達(dá)，8dpf后p204的表達(dá)量會(huì)逐漸減少，直至11dpf左右發(fā)現(xiàn)熒光

4、完全消失。p204-EGFP質(zhì)粒注射后導(dǎo)致斑馬魚表型變化，產(chǎn)生畸形，出現(xiàn)腹部變大、尾部彎曲等狀況。
　　 對(duì)注射后的斑馬魚胚胎，選取其中表達(dá)綠色熒光的胚胎進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)先天免疫相關(guān)的基因tbk(l)和sting,通過實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)p204注射后能夠引起相應(yīng)的先天免疫相關(guān)基因tbk(l)和sting達(dá)量在8hpf-48hpf階段比對(duì)照組都有明顯上調(diào)，而之前4hpf階段的表達(dá)量并沒有明顯變化。另外進(jìn)行了相應(yīng)基因的原

5、位雜交檢測(cè)，其結(jié)果與實(shí)時(shí)定量結(jié)果相吻合。為了能夠獲得p204整合進(jìn)入斑馬魚基因組中的突變體，我們利用tol2轉(zhuǎn)座子攜帶p204，構(gòu)建tol2-p204的載體，并將其和TP轉(zhuǎn)座酶一起共注射到斑馬魚受精卵中。研究結(jié)果表明:1.外源p204基因可以在一定程度上影響斑馬魚的發(fā)育，造成斑馬魚的畸形;2.p204能夠影響斑馬魚先天免疫，參與相關(guān)信號(hào)通路;3.tol2-p204載體構(gòu)建成功，并且導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，但p204在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)不夠穩(wěn)定