肝再生增強(qiáng)因子干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制探討.pdf

1、目的：觀察肝再生增強(qiáng)因子(Augumenter of liverregeneration，ALR)在體外對慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法：NRK-52E細(xì)胞用含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37<'0>C、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱。將細(xì)胞分為(1)正常對照組(N)：用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)慶大霉素(Gentamicin sulfate,GM)損傷組，在培養(yǎng)

2、液中加入終濃度為1.6mg/ml的GM；(3)ALR干預(yù)組：根據(jù)給予ALR的不同劑量分為G+A1組和G+A2組兩個(gè)亞組。G+A1組：在培養(yǎng)液中加入終濃度為1.6mg/ml的GM，同時(shí)加入終濃度15ug/ml的ALR；G+A2組：在培養(yǎng)液中加入終濃度為1.6mg/ml的GM，同時(shí)加入終濃度25ug/ml的ALR。分別培養(yǎng)細(xì)胞24h，48h。采用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳及Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢

3、測，從形態(tài)學(xué)、定性和定量檢測上述各組細(xì)胞凋亡狀況。用Western-blot和RT-PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白和mRNA表達(dá)情況。采用Western Blot檢測各組中磷酸化的Akt及總的Akt表達(dá)水平以及PI3K的表達(dá)。 結(jié)果： 1、熒光顯微鏡下觀察經(jīng)AO/EB 染色的各組細(xì)胞，正常對照組在24小時(shí)大多數(shù)細(xì)胞核染色質(zhì)呈綠色，僅見少數(shù)核呈亮綠色或橘紅色，呈固縮狀的凋亡細(xì)胞；到48小時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)略有

4、增加。GM 損傷組作用24小時(shí)后，可見較多的核著亮綠色或橘紅色、呈固縮狀或片段狀的凋亡細(xì)胞，當(dāng)時(shí)間延長到48小時(shí)，凋亡細(xì)胞進(jìn)一步增多。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和染色狀況，隨機(jī)選取視野計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：不同濃度ALR干預(yù)組(15ug/ml或25ug/ml)作用24h及48h，NRK-52E細(xì)胞凋亡率均較未予ALR干預(yù)的GM處理組明顯減少(均P<0.05)，而濃度較高的ALR干預(yù)組(25ug/ml)作用更為明顯。 2、DNA瓊脂

5、糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，在24小時(shí)，GM 處理組細(xì)胞DNA的瓊脂糖凝膠電泳未見到凋亡典型的梯形條帶。在48h，正常對照組仍未見梯形條帶。GM組和ALR干預(yù)組(15ug/ml或25ug/ml)均呈現(xiàn)出由不同大小的DNA片段組成的數(shù)條特征性凋亡梯形條帶，大小為180～200bp的不同倍數(shù)。根據(jù)48小時(shí)各組條帶的灰度值x面積分析，不同濃度ALR干預(yù)組(15ug/ml或25ug/ml)均較未予ALR干預(yù)的GM處理組的片段化程度明顯減輕(P<0.

6、05)，而濃度較高的ALR干預(yù)組(25ug/ml)作用更為明顯。 3、Annexin V/PI雙染的流式細(xì)胞儀顯示，正常組細(xì)胞在24h有極少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率1.04％；而GM損傷組為6.78％；ALR干預(yù)組(15ug/ml或25ug/ml)細(xì)胞的凋亡率分別為5.40％和3.53％，與GM損傷組比較有所下降(P<0.05)。在48小時(shí)后，正常對照組細(xì)胞凋亡率略有增加為3.81％，GM組凋亡率明顯增加至14.32％，ALR干預(yù)

7、組(15ug/ml或25ug/ml)細(xì)胞凋亡率的增加程度均較GM處理組明顯降低，分別為10.31％和8.44％，差異有顯著性(P<0.05)。 4、Western-blot和RT-PCR 檢測結(jié)果：分別檢測培養(yǎng)細(xì)胞在24h、48h時(shí)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平，正常對照組細(xì)胞僅有少量表達(dá)，GM組 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，ALR干預(yù)組(15ug/ml或25 ug/ml)與GM組比較，隨著ALR劑量

8、的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量呈上升趨勢，而Bax蛋白呈下降趨勢，Bcl-2/Bax比值顯著增加(P<0.05)，在48小時(shí)最明顯。檢測細(xì)胞處理48小時(shí)各組Bcl-2，Bax mRNA表達(dá)情況，與同時(shí)間點(diǎn)各組蛋白表達(dá)趨勢相同，ALR干預(yù)組(15ug/ml或25ug/ml)與GM組比較，隨著ALR劑量的增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)量呈上升趨勢，而Bax mRNA呈下降趨勢，Bcl-2/Bax比值顯著增加(P<0.05)，在多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(

9、1小時(shí)，2小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí))檢測到總Akt蛋白的表達(dá)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)總Akt變化無顯著性(p>0.05)，GM與ALR干預(yù)組之間總Akt表達(dá)量無差別(p>0.05)。未發(fā)現(xiàn)磷酸化Akt及PI3K的表達(dá)和變化。 結(jié)論： 1、ALR對慶大霉素誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡具有抑制作用，表明ALR可能通過抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡而減輕腎毒性藥物對小管上皮細(xì)胞的損傷。 2、目前對細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，但已知Bcl-