HCV十表位抗原的恒河猴免疫學(xué)效果評(píng)價(jià).pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus、HCV)感染導(dǎo)致的慢性肝炎疾病,現(xiàn)在已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。鑒于目前對(duì)于HCV慢性感染尚無(wú)特異性治療方法,且副作用較大,因此研制HCV疫苗對(duì)于控制HCV流行具有重要意義。HCV的高度異源性是HCV疫苗研究的重要障礙,通過(guò)對(duì)來(lái)自全球的多株HCV序列分析表明,至少存在6種主要基因型和大約100種基因亞型。由于HCV基因序列存在高度變異性、感染力弱,并且缺乏有效的細(xì)胞和動(dòng)物感染模型,因此采

2、用傳統(tǒng)方法研制丙肝疫苗難以達(dá)到目的。多表位疫苗,作為通過(guò)篩選與組合優(yōu)勢(shì)抗原表位(包括T細(xì)胞、B細(xì)胞表位)的新型疫苗,能夠產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答進(jìn)而清除病毒,其優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)選擇最具免疫保護(hù)潛力的表位以覆蓋盡量多的病毒亞型和誘導(dǎo)機(jī)體全面的抗病毒免疫應(yīng)答,它能有效地應(yīng)付病原微生物的變異,克服主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的遺傳限制。
　　 本研究選取多個(gè)HCV基因型中的十個(gè)保守性表位,構(gòu)建了重組抗原多肽CB3的表達(dá)基因,

3、并將其連接入載體pBV220進(jìn)行原核表達(dá),經(jīng)包涵體洗滌、溶解、復(fù)性及離子交換柱純化后,獲得純度較高的目的多肽CB3。
　　 在免疫原性評(píng)價(jià)研究中,以恒河猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面對(duì)CB3的免疫學(xué)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究分別使用1.5μg和30μg劑量的多肽CB3以0、1、6月的免疫程序免疫恒河猴后,采用ELISA方法檢測(cè)到免疫動(dòng)物體內(nèi)有特異性抗體的產(chǎn)生,ELISPOT檢測(cè)到抗原特異性IFN-γ細(xì)胞因子。與對(duì)照組相

4、比,均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且30μg劑量組的免疫應(yīng)答強(qiáng)于15μg組。
　　 在保護(hù)性抗體評(píng)價(jià)方面,本研究采用HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型對(duì)免疫后動(dòng)物血清中的中和抗體進(jìn)行了檢測(cè)。首先將體外轉(zhuǎn)錄得到的HCV JFH-1株基因組RNA轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞,免疫熒光、Western實(shí)驗(yàn)證明有HCV病毒蛋白表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明有HCV病毒基因組的復(fù)制。在蛋白水平和RNA水平上證實(shí)了HCV病毒的產(chǎn)生后,進(jìn)行體外中和實(shí)驗(yàn)。結(jié)果