耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶基因型研究及相關(guān)整合子分析.pdf

1、廣州市第一人民醫(yī)院2001-2002年曾爆發(fā)呼吸機(jī)相關(guān)性泛耐藥銅綠假單胞菌(Pan resistant PselJdomonas aeruginosa，PRPA)感染，出現(xiàn)了對(duì)亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、左旋氧氟沙星、氨基糖甙類抗生素等除多黏菌素外臨床可獲得抗生素均耐藥的嚴(yán)重情況，使臨床醫(yī)生感到束手無(wú)策．前期體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明使用金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑乙二胺四乙酸(EDTA)可恢復(fù)PRPA對(duì)亞

2、胺培南的部分敏感性，提示會(huì)屬β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生可能是PRPA耐藥的重要原因。金屬β-內(nèi)酰胺酶是近10年新發(fā)現(xiàn)的一類對(duì)抗碳青霉烯類抗生素和第三代頭孢菌素在內(nèi)的β內(nèi)酰胺類抗生素(包括克拉維酸、舒巴坦和他嘩巴坦)高度耐藥的β內(nèi)酰胺酶。本研究旨在調(diào)查金屬β-內(nèi)酰胺酶及相關(guān)整合子在泛耐藥、MDRP上所起的作用，結(jié)合臨床資料進(jìn)行對(duì)比分析，以期提供相應(yīng)的分子流行病學(xué)資料。 第一部分：泛耐藥、多藥耐藥及普通感染銅綠假單胞菌的篩選及金屬β-內(nèi)酰胺

3、酶基因型及表型的鑒定 目的：1．檢測(cè)泛耐藥、多藥耐藥及普通感染銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶存在情況；2．確定此金屬β-內(nèi)酰胺酶基因型。 方法：1．在廣州市第一人民醫(yī)院細(xì)菌室通過(guò)Whonet5.3軟件(世界衛(wèi)生組織推薦)查找2002年-2005年符合條件泛耐藥、多藥耐藥、普通感染銅綠假單胞菌。采用VITEK 2全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行重新鑒定。K-B紙片法對(duì)其重新進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，并將其歸類；2．采用聚合酶鏈反應(yīng)

4、(polymerase chainreaction，PCR)擴(kuò)增金屬β-內(nèi)酰胺酶基因。登陸Genebank后分析其基因型；3．采用紙片協(xié)同法和金屬β-內(nèi)酰胺酶E-Test試紙條法對(duì)上述三組銅綠假單胞菌進(jìn)行金屬β-內(nèi)酰胺酶表型檢測(cè)，與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行方法學(xué)比較：4．采用Fisher 確切概率法，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1．經(jīng)VITEK 2全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)鑒定確定為銅綠假單胞菌，體外藥敏結(jié)果

5、證實(shí)PRPA共7株，多藥耐藥銅綠假單胞菌(Multi-drugresistant Pseudomonas aeruginosa，MDRP)為10株，普通感染銅綠假單胞菌為10株，共27株臨床菌株；2．采用PCR法共檢出7株IMP金屬β-內(nèi)酰胺酶基因陽(yáng)性，大小約為500bp，序列分析與IMP-1型有99％同源性，設(shè)計(jì)合成IMP-1型上下游引物，繼續(xù)PCR反應(yīng)，7株均陽(yáng)性，大小約800bp左右，測(cè)序序列分析證實(shí)為IMP-1金屬β-內(nèi)酰胺酶基

6、因型(100％同源性)；3．金屬β-內(nèi)酰胺酶E-Test檢測(cè)方法總符合率(96.5％)高于紙片協(xié)同法(85.1％)，E-Test檢測(cè)方法特異率(100％)高于紙片協(xié)同法(85％)，兩者敏感率相同(85.7％)，E-Test檢測(cè)方法陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(100％)高于紙片協(xié)同法(66.6％)，其陰性預(yù)測(cè)值(95.2％)高于紙片協(xié)同法(94.4％)；4．經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，泛耐藥、多藥耐藥及普通感染銅綠假單胞菌中產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

7、0001)． 結(jié)論：1．本院PRPA均產(chǎn)IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶，并由質(zhì)粒介導(dǎo)；2．E-Test法檢測(cè)金屬β-內(nèi)酰胺酶要優(yōu)于紙片協(xié)同法，是種快速可靠的檢測(cè)金屬酶的方法；3．產(chǎn)IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶菌不是本院MDRP的主要耐藥機(jī)制，由MDRP轉(zhuǎn)變?yōu)镻RPA時(shí)，金屬β-內(nèi)酰胺酶在其耐藥性上起到了重要作用。 第二部分：金屬β-內(nèi)酰胺酶基因相關(guān)整合子分析及結(jié)合臨床資料對(duì)比研究 目的：1．研究金屬β-內(nèi)酰胺酶是否

8、存在相關(guān)整合子；2．分析相關(guān)整合子類型；3．提供本院金屬酶整合子相關(guān)分子流行病學(xué)資料；4．結(jié)合臨床資料分析，以期給臨床有指導(dǎo)意義。 方法：1針對(duì)整合子基因上下游保守序列設(shè)計(jì)、合成引物，分段PCR法檢測(cè)整合子-基因盒系統(tǒng)在銅綠假單胞菌中的存在情況；2．利用金屬β-內(nèi)酰胺酶基因引物和整合子可變區(qū)兩端保守區(qū)引物，進(jìn)行整合子可變區(qū)的PCR-mapping和DNA測(cè)序，分析整合子-基因盒系統(tǒng)與會(huì)屬β-內(nèi)酰胺酶的關(guān)聯(lián)性；3．結(jié)合產(chǎn)金屬β-內(nèi)

9、酰胺酶PRPA相應(yīng)病人資料結(jié)合耐藥譜、基因譜進(jìn)行分析。 結(jié)果：1．PCR法共檢出7株P(guān)RPA均含有整合子，整合子攜帶率為100％(7/7)，上游長(zhǎng)度約為1200bp，下游長(zhǎng)度約為4，500bp；2．序列分析發(fā)現(xiàn)該序列與1999年日本發(fā)現(xiàn)的名為In31整合子有99％的同源性，IMP-1基因?yàn)樵摙耦愓献拥谝粋€(gè)基因盒；3．該7株P(guān)RPA均來(lái)自呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU)慢性阻塞性肺疾病或外傷的病人，曾使用過(guò)大量廣譜抗生素，接受過(guò)機(jī)械