腎肉瘤樣癌細胞系的建立和腎癌噬菌體展示肽庫的構(gòu)建.pdf

1、目的:建立漢族人腎肉瘤樣癌細胞系，研究該細胞系的生物學特性，篩選腎肉瘤樣癌高轉(zhuǎn)移性細胞亞型;構(gòu)建腎癌噬菌體展示肽庫和腎透明細胞癌特異性噬菌體展示肽庫，進行腎細胞癌早期檢測分子標志物的篩選。
　　 方法:(1)采用1例腎肉瘤樣癌新鮮手術(shù)標本，于手術(shù)后30-60min內(nèi)用植塊法進行體外培養(yǎng)，確定腫瘤病理學特點和染色體眾數(shù)，記錄細胞系的生長曲線，集落形成率，應用流式細胞儀檢測細胞的腫瘤干細胞表面標志物。
　　 (2)構(gòu)建腎癌噬

2、菌體展示肽庫:收集腎癌組織標本30例和腎癌細胞系3種48瓶。用Trizol法抽提總RNA，用純化試劑盒抽提mRNA，再經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、末端平齊化、片段長短篩選、加接頭、雙酶切、加載體臂、體外包裝等一系列反應，成功地構(gòu)建了腎癌噬菌體展示肽庫。
　　 (3)腎癌特異性的相關(guān)噬菌體的富集:進行五輪正反向的親和篩選以富集可以和腎癌患者血清自身抗體相結(jié)合的特異的噬菌體。
　　 (4)腎癌特異性噬菌體的篩選:隨機挑選了五輪篩選后的200

3、0個噬菌體克隆進行ELISA初篩。
　　 結(jié)果:(1)腫瘤組織樣本免疫組化結(jié)果顯示:Vimentin、CD10、CAM、Ki67呈強陽性，腎肉瘤樣癌細胞系可長期生長和穩(wěn)定傳代，經(jīng)歷12個月傳120代。倍增時間為18小時。細胞形態(tài)不規(guī)則、線粒體發(fā)育不全，胞漿內(nèi)糖原聚集;細胞普遍存在超二倍體現(xiàn)象，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常明顯;腫瘤干細胞標志物CD24，CD99，CAM，E-cadherin表達陽性;細胞具有一定的運動侵襲能力，混合細胞系

4、成瘤率100％，細胞亞克隆無致瘤能力。
　　 (2)由腎癌組織建立的噬菌體展示肽庫滴度為2.52×105pfu/ml，重組率為95.83％，500bp以上的插入片段占65.2％。由腎癌細胞系建立的噬菌體展示肽庫滴度為1×105pfu/ml，重組率為33.33％，最大插入片段1200bp。腎透明細胞癌特異性噬菌體展示肽庫
　　 結(jié)論:(1)利用漢族人腎肉瘤樣癌成功建立了細胞系，該細胞系具有腫瘤干細胞特征性表面標志。