腎肉瘤樣癌細(xì)胞系的建立和腎癌噬菌體展示肽庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、目的:建立漢族人腎肉瘤樣癌細(xì)胞系，研究該細(xì)胞系的生物學(xué)特性，篩選腎肉瘤樣癌高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞亞型;構(gòu)建腎癌噬菌體展示肽庫(kù)和腎透明細(xì)胞癌特異性噬菌體展示肽庫(kù)，進(jìn)行腎細(xì)胞癌早期檢測(cè)分子標(biāo)志物的篩選。
　　 方法:(1)采用1例腎肉瘤樣癌新鮮手術(shù)標(biāo)本，于手術(shù)后30-60min內(nèi)用植塊法進(jìn)行體外培養(yǎng)，確定腫瘤病理學(xué)特點(diǎn)和染色體眾數(shù)，記錄細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線，集落形成率，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　 (2)構(gòu)建腎癌噬

2、菌體展示肽庫(kù):收集腎癌組織標(biāo)本30例和腎癌細(xì)胞系3種48瓶。用Trizol法抽提總RNA，用純化試劑盒抽提mRNA，再經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄、末端平齊化、片段長(zhǎng)短篩選、加接頭、雙酶切、加載體臂、體外包裝等一系列反應(yīng)，成功地構(gòu)建了腎癌噬菌體展示肽庫(kù)。
　　 (3)腎癌特異性的相關(guān)噬菌體的富集:進(jìn)行五輪正反向的親和篩選以富集可以和腎癌患者血清自身抗體相結(jié)合的特異的噬菌體。
　　 (4)腎癌特異性噬菌體的篩選:隨機(jī)挑選了五輪篩選后的200

3、0個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行ELISA初篩。
　　 結(jié)果:(1)腫瘤組織樣本免疫組化結(jié)果顯示:Vimentin、CD10、CAM、Ki67呈強(qiáng)陽(yáng)性，腎肉瘤樣癌細(xì)胞系可長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代，經(jīng)歷12個(gè)月傳120代。倍增時(shí)間為18小時(shí)。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、線粒體發(fā)育不全，胞漿內(nèi)糖原聚集;細(xì)胞普遍存在超二倍體現(xiàn)象，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常明顯;腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD24，CD99，CAM，E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性;細(xì)胞具有一定的運(yùn)動(dòng)侵襲能力，混合細(xì)胞系

4、成瘤率100％，細(xì)胞亞克隆無(wú)致瘤能力。
　　 (2)由腎癌組織建立的噬菌體展示肽庫(kù)滴度為2.52×105pfu/ml，重組率為95.83％，500bp以上的插入片段占65.2％。由腎癌細(xì)胞系建立的噬菌體展示肽庫(kù)滴度為1×105pfu/ml，重組率為33.33％，最大插入片段1200bp。腎透明細(xì)胞癌特異性噬菌體展示肽庫(kù)
　　 結(jié)論:(1)利用漢族人腎肉瘤樣癌成功建立了細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有腫瘤干細(xì)胞特征性表面標(biāo)志。