胸腺素β4對膀胱癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控作用的實驗研究.pdf

1、第一部分胸腺素β4與人膀胱移行細(xì)胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系
　　 目的：探討人胸腺素β4與膀胱移行上皮癌(BTCC)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性，以及與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 方法：選用膀胱移行細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本60例，每例標(biāo)本均選用癌組織中心、癌旁組織及其遠(yuǎn)端正常黏膜對照。采用定量RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測切除標(biāo)本中的Tβ4、ILK、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)，并分析

2、與各臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 (1)Tβ4在BTCC組織中的表達(dá)明顯高于正常黏膜，其在深層浸潤組中的表達(dá)高于淺層浸潤組；ILK在BTCC組織中的表達(dá)明顯高于正常黏膜；β-catenin在BTCC組織中的表達(dá)高于正常黏膜；E-cadherin在BTCC組織中的表達(dá)明顯低于正常黏膜；
　　 (2)Tβ4與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與ILK、β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 結(jié)

3、論：胸腺素β4與膀胱移行上皮癌分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而在膀胱移行上皮癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。
　　 第二部分基因沉默胸腺素β4 對膀胱移行細(xì)胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)作用
　　 目的：探討胸腺素β4基因沉默對膀胱癌細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步研究其在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　 方法：使用針對Tβ4的慢病毒載體（Lenti-Tβ4）轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株T24。采用定量RT-PCR、Western

4、 blot 法檢測Tβ4、ILK和上皮性標(biāo)記基因E-cadherin、β-catenin的表達(dá)改變；Immunofluorescence 法檢測ILK、E-cadherin、β-catenin在轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞中的表達(dá)改變；細(xì)胞劃痕實驗、Boyden 小室體外侵襲實驗、AO/EB 熒光染色法反映細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能和凋亡的變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后的T24細(xì)胞，Tβ4、ILK和β-catenin基因或蛋白表達(dá)下調(diào)，而上皮標(biāo)記基因E-ca

5、dherin表達(dá)增強(qiáng)；Immunofluorescence 顯示ILK和β-catenin在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中表達(dá)減弱，而E-cadherin在胞膜中表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)向正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)染后的T24細(xì)胞體外遷移能力與侵襲力下降，細(xì)胞凋亡增多。
　　 結(jié)論：腫瘤細(xì)胞中的Tβ4表達(dá)下調(diào)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)表型，而向正常上皮表型轉(zhuǎn)化，降低腫瘤轉(zhuǎn)移潛能。
　　 第三部分 Tβ4-siRNA 慢病毒載體逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

6、化的體內(nèi)實驗研究
　　 目的：構(gòu)建可熒光示蹤的膀胱癌小鼠皮下移植瘤模型及肺轉(zhuǎn)移模型，并探討活體內(nèi)抑制Tβ4基因表達(dá)對膀胱癌生長侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成的影響，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 ⑴選用膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株EJ，體外擴(kuò)增培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液后注射于BALB/C 小鼠頸背部皮下，待有肉眼可見瘤塊后，處死小鼠并取出腫瘤組織。對腫瘤組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，免疫組化方法檢測Tβ4、ILK、E-cadherin

7、和β-catenin在移植瘤中的表達(dá)，TUNEL 方法檢測活體內(nèi)抑制Tβ4基因表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞的促凋亡作用，體外血管形成實驗檢測Tβ4表達(dá)下調(diào)對血管生成的影響。
　　 ⑵將膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株EJ 懸液接種于BALB/C 小鼠尾靜脈內(nèi)，于術(shù)后第20天處死小鼠，觀察胸腔及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶大小、數(shù)量，觀察生存天數(shù)，記錄遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。
　　 結(jié)果：⑴EJ細(xì)胞以慢病毒Lenti-Tβ4 轉(zhuǎn)染后形成的膀胱癌移植瘤與EJ細(xì)胞慢病毒Lent

8、i-GFP 轉(zhuǎn)染(陰性對照)后形成的移植瘤比較，移植瘤體積、濕重、小鼠平均生存天數(shù)均存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；移植瘤組織HE 染色發(fā)現(xiàn)，干擾移植瘤中Tβ4基因表達(dá)，癌組織惡性程度相較于未干擾組低；Lenti-Tβ4組中Tβ4、ILK和β-catenin 陽性表達(dá)率明顯低于陰性對照組，而E-cadherin 陽性表達(dá)率明顯高于陰性對照組；Lenti-Tβ4組凋亡率明顯高于陰性對照組；與空白對照組、陰性對照組相比，Lenti-Tβ4 轉(zhuǎn)染

9、組促進(jìn)血管形成能力下降66.8％，有統(tǒng)計學(xué)意義。⑵BALB/C 新生仔鼠尾靜脈注入膀胱癌細(xì)胞EJ后，20d后解剖取出肺組織，陰性對照組肺組織表面不光滑，肉眼見肺表面彌漫性斑塊，最大直徑1.5cm，而Lenti-Tβ4 轉(zhuǎn)染組肺組織中轉(zhuǎn)移灶明顯變小或未見明顯轉(zhuǎn)移灶，各組小鼠的肝臟、脾臟、心臟、骨均未發(fā)現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：攜帶干擾序列Tβ4-siRNA的慢病毒能有效地抑制Tβ4基因的表達(dá)，從而抑制膀胱癌細(xì)胞體內(nèi)的侵襲能力，同時