芹菜素對(duì)人膀胱癌和前列腺癌的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 芹菜素對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制的研究
　　背景：
　　在我國(guó)，膀胱癌是泌尿系腫瘤發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近年來(lái)，膀胱癌的發(fā)病率還在呈現(xiàn)一種上升的趨勢(shì)。膀胱癌的主要治療手段是手術(shù)和化療等。芹菜素是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于我們?nèi)粘Ｄ芙佑|到的水果和蔬菜中。芹菜素被證明在多種腫瘤中具有抑癌作用，但其對(duì)膀胱癌的作用尚未得到驗(yàn)證。
　　目的：
　　本研究

2、通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探索芹菜素對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞系的影響和相應(yīng)的作用機(jī)制，并通過(guò)體內(nèi)的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　方法：
　　芹菜素以不同濃度（10-80μM）和不同時(shí)間(24-72h)作用于T24細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞在增殖和活性方面的改變，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在周期和凋亡方面的改變，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)能力方面的改變，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)蛋白的改變。采用BSP克

3、隆測(cè)序法檢測(cè)PTEN的甲基化水平。構(gòu)建裸鼠成瘤模型檢測(cè)芹菜素在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤的影響。
　　結(jié)果：
　　1.芹菜素以一種時(shí)間-劑量依賴的方式抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為隨著濃度的升高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。
　　2.芹菜素作用濃度為10和20μM時(shí)，T24細(xì)胞的增殖未被明顯抑制，當(dāng)濃度增加到40和80μM時(shí)，增殖被明顯抑制。作用時(shí)間為24h，48h和72h的IC50濃度分別為82.5，52.9和4

4、3.8μM。
　　3.芹菜素以10和20μM的濃度作用于T24細(xì)胞24小時(shí)后，經(jīng)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力都明顯減弱。
　　4.芹菜素以20，40和80μM的濃度作用于T24細(xì)胞24小時(shí)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀（PI和annexinⅤ雙染法）檢測(cè)，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，以晚期凋亡的增加為主，并隨著濃度的提高，凋亡比例相應(yīng)提高。
　　5.芹菜素以20，40，80，120和160μM的濃度作用于T24細(xì)胞24

5、小時(shí)后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的G2/M期阻滯，并隨著濃度的升高，G2/M期阻滯愈加明顯。
　　6.芹菜素以20，40和80μM的濃度作用于T24細(xì)胞24小時(shí)后，隨著濃度增加，細(xì)胞pro caspase-3的表達(dá)逐漸下降，active caspase-3的表達(dá)逐漸上升，PARP裂解片段的表達(dá)逐漸上升，細(xì)胞中p-Akt、PDK和PI3K的表達(dá)逐漸下降，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Bad的表達(dá)逐漸升高，抗凋亡蛋白Bcl-xl

6、、Bcl-2的表達(dá)逐漸下降，而Akt的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。
　　7.芹菜素與PI3K抑制劑LY294002同時(shí)作用后，與芹菜素單獨(dú)作用相比，芹菜素導(dǎo)致的p-Akt的下降，PARP裂解片段的增加，active caspase-3的上調(diào)都不同程度得到了削弱。
　　8.芹菜素以20，40和80μM的濃度作用于T24細(xì)胞后，PTEN蛋白的表達(dá)逐漸上升，并且在T24，UM-UC-3和5637細(xì)胞中，芹菜素都下調(diào)了PTEN的甲基化水平。<

7、br>　　9.在裸鼠膀胱癌成瘤實(shí)驗(yàn)中，隨著局部注射芹菜素濃度的增加，裸鼠背部形成的腫瘤體積逐漸縮小。
　　結(jié)論：
　　芹菜素以濃度-時(shí)間依賴的方式抑制T24細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其凋亡和G2/M期周期阻滯，抑制T24細(xì)胞的遷移侵襲能力。芹菜素抑制T24細(xì)胞PI3K/PDK/Akt通路的激活，調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。
　　第二部分 芹菜素增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制的研究
　　背景：

8、>　　聯(lián)合化療（MVAC方案或GC方案等）是治療轉(zhuǎn)移性膀胱癌的一線方案，鉑是最有效的膀胱癌全身化療藥物，然而以順鉑為基礎(chǔ)的一線化療方案增加的中位生存時(shí)間僅為7-9個(gè)月。對(duì)順鉑產(chǎn)生藥物抵抗是膀胱癌化療的一個(gè)重大障礙，核苷酸切除修復(fù)(NER)是順鉑耐藥重要機(jī)制之一，而ERCC-1是NER途徑的重要因素。
　　目的：
　　本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究芹菜素與順鉑聯(lián)合使用對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　順鉑

9、以不同濃度(5-30μM)作用于T24細(xì)胞24小時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性的改變。選取順鉑和芹菜素單獨(dú)或共同作用于T24細(xì)胞，采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性的改變，采用Trasnwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變，采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ERCC-1 mRNA的表達(dá)，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)蛋白的改變。
　　結(jié)果：
　　1.順鉑以濃度依賴的方式抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖，濃度越高，抑制作

10、用越明顯。順鉑作用于T24細(xì)胞24小時(shí)的IC50約為14.8μM。
　　2.順鉑（15μM）和芹菜素（4μM）單獨(dú)或共同作用于T24細(xì)胞24小時(shí)，MTT實(shí)驗(yàn)表明芹菜素增強(qiáng)了順鉑對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用，克隆形成實(shí)驗(yàn)表明芹菜素增強(qiáng)了順鉑對(duì)T24細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用。
　　3.順鉑(10μM)和芹菜素（20μM）單獨(dú)或共同作用于T24細(xì)胞24小時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)表明芹菜素增強(qiáng)了順鉑對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的抑制作用。

11、
　　4.順鉑（15μM）和芹菜素（40μM）單獨(dú)或共同作用于T24細(xì)胞24小時(shí)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明順鉑上調(diào)了T24細(xì)胞ERRC-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，而芹菜素明顯抑制了順鉑對(duì)ERRC-1 mRNA和蛋白的上調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　順鉑以濃度依賴的方式抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖能力。芹菜素能明顯增強(qiáng)順鉑對(duì)T24細(xì)胞的抑制作用，并且芹菜素能明顯下調(diào)順鉑導(dǎo)致的T24細(xì)胞中ERCC-1的上調(diào)效果。
　　第三部分

12、 芹菜素對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響及其機(jī)制的研究
　　背景：
　　在歐美國(guó)家，前列腺癌是男性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并且是導(dǎo)致死亡的腫瘤的第二位。在我國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率也在逐年上升。相比歐美國(guó)家，亞洲男性較低的前列腺癌發(fā)病率與飲食因素有一定的聯(lián)系。有研究表明芹菜素對(duì)前列腺癌有一定的抑制作用，但能否抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移尚未可知。
　　目的：
　　本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芹菜素對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能

13、力的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　芹菜素以不同濃度(10-80μM)和不同時(shí)間(24-48h)作用于DU145細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性的改變，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變，采用RT-PCR檢測(cè)MMPsmRNA的改變，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)蛋白的改變。
　　結(jié)果：
　　1.芹菜素以一種時(shí)間-劑量依賴的方式抑制前列腺癌DU

14、145細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。
　　2.芹菜素的作用濃度為40和80μM時(shí)，對(duì)DU145細(xì)胞的IC50值在24和48小時(shí)分別為80.8和49.3μM。
　　3.芹菜素以10和20μM的濃度作用于DU145細(xì)胞24小時(shí)后，劃痕試驗(yàn)表明細(xì)胞的遷移能力得到了抑制，Transwell實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力得到了抑制。
　　4.芹菜素以20，40和80μM的濃度作用于DU145細(xì)胞24小時(shí)

15、后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞出現(xiàn)了G2/M期阻滯。隨著濃度的增加，G2/M期的比例逐漸升高。
　　5.芹菜素5，10和20μM的濃度作用于DU145細(xì)胞24小時(shí)后，隨著濃度的增加，細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)逐漸升高，Snail和Vimentin蛋白的表達(dá)逐漸下降，MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)都逐漸下降。
　　結(jié)論：
　　芹菜素以濃度-時(shí)間依賴的方式抑制DU145細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)G2/M期周