群體感應(yīng)和環(huán)二鳥苷酸對(duì)銅綠假單胞菌致病因子的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，已成為人類生存的最大危機(jī)。我國(guó)是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，每年約有8萬(wàn)人死于抗生素的泛濫使用，細(xì)菌耐藥問題與其它國(guó)家相比更加嚴(yán)峻，專家預(yù)言，我國(guó)有可能率先進(jìn)入“后抗生素時(shí)代”，亦即抗生素發(fā)現(xiàn)之前的時(shí)代。因此，如何解決細(xì)菌耐藥的難題和研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種臨床上最常見的引起嚴(yán)重獲得性感染的條件致病

2、菌，能伺機(jī)感染任何部位，如燒傷處傷口、角膜、尿道及肺部等，并引起細(xì)菌性心內(nèi)膜炎及腸胃炎。研究表明，PA生物膜(Biofilm，BF)的形成是其產(chǎn)生抗生素耐藥的主要誘因。生物膜是由細(xì)菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦形成生物膜，細(xì)菌將具有極強(qiáng)的抗生素耐藥性(比浮游細(xì)菌高100-1000倍)。對(duì)細(xì)菌生物膜的研究將為新型抗生素的研發(fā)開辟新的途徑。 生物膜的形成受復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，以往的研究闡明了群體感應(yīng)(Q

3、uorumSensing，QS)和細(xì)菌的第二信使環(huán)二鳥苷酸(Cyclic Diguanylic Acid，c-di-GMP)均能調(diào)控PA的BF形成。然而，目前QS和c-di-GMP之間的關(guān)系尚不清楚。本研究擬通過構(gòu)建QS缺失突變株、c-di-GMP合成或降解酶過表達(dá)株，利用激光共聚焦、定量PCR等技術(shù)研究PA中QS和c-di-GMP信號(hào)通路之間的內(nèi)在關(guān)系。 構(gòu)建了PAO1群體感應(yīng)單缺失菌株JP1(ΔlasI)、PDO100(Δr

4、hlI)和雙缺失菌株MW(ΔlasIΔrhlI)，通過對(duì)群體感應(yīng)單缺失和雙缺失菌株在運(yùn)動(dòng)能力、致病因子的產(chǎn)生和生物膜形成能力的比較，表明Rhl-QS系統(tǒng)對(duì)菌株影響最為明顯，Rhl-QS缺失以后，菌株的運(yùn)動(dòng)能力降低，不能產(chǎn)生鼠李糖酯和綠膿菌素等致病因子。利用靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種模型評(píng)價(jià)了群體感應(yīng)對(duì)生物膜的影響，結(jié)果顯示在靜態(tài)條件下群體感應(yīng)缺失有利于生物膜形成，但是在動(dòng)態(tài)模型下群體感應(yīng)缺失生物膜形成減少。測(cè)定了野生型和群體感應(yīng)缺失菌株對(duì)氨基糖苷類

5、抗生素阿米卡星的敏感性，結(jié)果表明，生物膜形成后菌株的抗生素耐藥性比浮游狀態(tài)提高了約黏附器官的變化，結(jié)果表明c-di-GMP增加后細(xì)胞表面的疏水性降低，多糖合成酶基因pelA和pelD的轉(zhuǎn)錄上調(diào)；原子力顯微鏡和投射電鏡結(jié)果未觀察到群體感應(yīng)缺失和環(huán)二鳥苷酸改變對(duì)細(xì)菌表面運(yùn)動(dòng)器官的影響。 綜上所述，在銅綠假單胞菌中環(huán)二鳥苷酸和群體感應(yīng)兩條信號(hào)通路并不是完全孤立的，環(huán)二鳥苷酸能調(diào)控Rhl-QS群體感應(yīng)系統(tǒng)，但是其對(duì)生物膜的影響并不完全依