依賴hTERT啟動(dòng)子的新型溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建和功能研究.pdf

1、背景:近20年來，溶瘤病毒療法已經(jīng)被證實(shí)是一種新型有效的腫瘤治療策略。如腺病毒、單純皰疹病毒和新城疫病毒等溶瘤病毒能夠在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制增殖并直接殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，毒性過高仍然是溶瘤病毒應(yīng)用中的主要障礙。為解決此問題，我們構(gòu)建了一種新型溶瘤單純皰疹病毒oHSV1_hTERTp_ICP4，該病毒基因組中關(guān)鍵復(fù)制基因ICP4由腫瘤特異性啟動(dòng)子hTERT啟動(dòng)子調(diào)控，這使得重組新病毒可以選擇性地在腫瘤細(xì)胞復(fù)制增殖，其安全性得到大幅度提高。并且，

2、我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)估了oHSV1_hTERTp_ICP4的溶瘤活性和腫瘤特異性。
　　 方法:本研究主要通過質(zhì)粒構(gòu)建和同源重組技術(shù)完成重組新病毒oHSV1_hTERTp_ICP4和兩種具有示蹤作用的病毒oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVpeGFP和oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_Luc2的構(gòu)建工作;通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)oHSV1_hTERTp_ICP4對(duì)多種腫瘤和正常細(xì)胞系的殺傷能力;通過滴度測(cè)

3、定方法檢測(cè)oHSV1_hTERTp_ICP4在多種細(xì)胞系中的增殖情況;通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦技術(shù)明確oHSV1_hTERTp_ICP4對(duì)正常人血細(xì)胞的感染復(fù)制情況;通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)oHSV1_hTERTp_ICP4在BGC823腫瘤模型中的抗腫瘤效果，并使用oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_Luc2示蹤檢測(cè)新病毒在荷瘤裸鼠中不同組織內(nèi)的復(fù)制表達(dá)情況;通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)oHSV1_hTERTp_ICP4感染細(xì)胞

4、后對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的影響;最后通過AnnexinV+PI雙染法檢測(cè)oHSV1_hTERTp_ICP4的細(xì)胞毒作用與細(xì)胞壞死和凋亡間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:(1)本研究成功構(gòu)建了含有hTERT啟動(dòng)子的新病毒oHSV1_hTERTp_ICP4及具有示蹤作用的病毒 oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_eGFP和oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_Luc2。(2) oHSV1_hTERTp_ICP4在端粒酶陽性腫

5、瘤細(xì)胞系中顯示出與原病毒oHSV1-17+相似的溶瘤活性;并且在端粒酶陰性細(xì)胞系中，沒有造成明顯的損傷（正常劑量MOI=0.1，1），而oHSV1-17+卻顯示出了明顯的殺傷作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)oHSV1_hTERTp_ICP4在多種細(xì)胞中的增殖能力和細(xì)胞毒作用具有一致性。(3)經(jīng)流式檢測(cè)，在正常人血細(xì)胞中oHSV1-17+-GFP感染后出現(xiàn)了少量的綠色熒光細(xì)胞，而oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_eGFP感染后幾乎沒有綠色

6、熒光細(xì)胞被發(fā)現(xiàn);另外，激光共聚焦結(jié)果顯示新病毒只在摻雜入的腫瘤細(xì)胞中顯著增殖，而在正常細(xì)胞中未發(fā)生顯著增殖，以上結(jié)果表明新病毒在正常人血細(xì)胞中具有良好的安全性。(4)在荷BGC823腫瘤裸鼠模型中，oHSV1_hTERTp_ICP4顯示出了與oHSV1-17+相似的抑瘤效果，但在生存期上卻明顯優(yōu)于后者;小鼠活體成像結(jié)果顯示oHSV1_hTERTp_ICP4CMVp_Luc2在荷BGC823腫瘤裸鼠的腫瘤內(nèi)能長(zhǎng)期存活，而在肌肉和皮下組織內(nèi)

7、則被迅速清除。(5)在病毒感染端粒酶陰性的Saos-2骨肉瘤細(xì)胞后，hTERT mRNA表達(dá)上升，說明病毒感染可能會(huì)造成hTERT啟動(dòng)子活性上升，然而病毒在該細(xì)胞中未能顯著復(fù)制，以及產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒作用，從另一方面表明該病毒對(duì)端粒酶陰性的正常細(xì)胞是安全的。隨后我們檢測(cè)了三個(gè)與hTERT啟動(dòng)子活性相關(guān)的細(xì)胞因子c-myc、Sp1和E2F1在oHSV1_hTERTp_ICP4感染后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)只有E2F1 mRNA在病毒感染后較對(duì)照組大

8、幅下降，結(jié)果暗示其可能與hTERT啟動(dòng)子活性變化有關(guān)。(6)端粒酶陽性BGC823細(xì)胞在被oHSV1_hTERTp_ICP4感染后壞死細(xì)胞比例對(duì)凋亡細(xì)胞比例的比值隨感染劑量的增加而升高，結(jié)果提示病毒的細(xì)胞毒作用以裂解細(xì)胞造成細(xì)胞壞死為主。
　　 結(jié)論:本研究首次在單純皰疹病毒中應(yīng)用hTERT啟動(dòng)子，構(gòu)建出新型溶瘤單純皰疹病毒oHSV1_hTERTp_ICP4。該病毒在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中被證明是一種安全性更好且具有良好溶瘤活性的新型溶瘤