溶瘤性單純皰疹病毒G47Δ對人乳腺癌等惡性腫瘤治療作用的研究.pdf

1、目的：
　　 溶瘤性單純皰疹病毒可以感染腫瘤細胞并在其內復制，通過直接的細胞毒作用殺滅腫瘤細胞，死亡的腫瘤細胞釋放大量病毒從而感染其他細胞。G47△為第三代溶瘤性單純皰疹病毒載體，它的γ34.5和α47基因均有缺失，并且在ICP6基因(編碼核糖核酸還原酶大亞基)區(qū)插入E.coli lacZ導致其失活。本研究旨在探討溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人乳腺癌細胞、乳腺永生化細胞及原代培養(yǎng)的正常乳腺細胞的細胞毒效應，并構建了乳腺癌肺轉移動

2、物模型，評估G47△對轉移性乳腺癌的治療作用，同時研究G47△對鼻咽癌、肝癌及甲狀腺癌細胞的細胞毒效應及對鼻咽癌皮下移植瘤模型的治療作用。
　　 材料與方法：
　　 第一部分：溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人乳腺癌治療作用
　　 體外培養(yǎng)人乳腺癌細胞MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231、ZR-75-1、乳腺永生化細胞MCF-10A、76N-tert及原代培養(yǎng)正常乳腺細胞HMEC1和

3、HMEC2，將G47△按不同滴度(MOI)加入培養(yǎng)液中，每天觀察細胞的生長狀態(tài)。G47△含有LacZ基因，采用X-gal染色檢測被G47△感染的細胞中LacZ基因而證實病毒的存在。通過Balb-c裸鼠尾靜脈注射人乳腺癌細胞MDA-MB-435構建乳腺癌肺轉移模型，21日后病毒治療組每周兩次尾靜脈注射2×107pfu G47△，共四次，空白對照組只注射病毒懸液。60天后處死兩組裸鼠，取肺行印度墨汁染色后計數(shù)其表面結節(jié)數(shù)。
　　 第

4、二部分：溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人鼻咽癌、肝癌、甲狀腺癌的治療作用
　　 體外培養(yǎng)人鼻咽癌細胞(SUNE1、CNE2)、人肝癌細胞(HEP-G2、HEP-3B、.BEL7405)及人甲狀腺癌細胞(ARO、FRO、WRO、KAT-5)，將G47△按不同滴度(MOI)加入培養(yǎng)液中，每天觀察細胞的生長狀態(tài)。采用X-gal染色檢測被G47△感染的細胞中LacZ基因而證實病毒的存在。通過Balb-c裸鼠尾雙側皮下注射人鼻咽癌細胞CNE

5、2構建鼻咽癌皮下模型，在腫瘤直徑約5mm時，病毒治療組每3天左側皮下瘤內注射1×106pfu G47△，共兩次，空白對照組只注射病毒懸液。游標卡尺測量腫瘤直徑并計算腫瘤體積(V=a×b2/2)。腫瘤最大直徑達18mm時處死裸鼠，比較兩組裸鼠腫瘤大小。
　　 結果：
　　 第一部分。溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人乳腺癌治療作用G47△對人乳腺癌細胞MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3及乳腺永生化細胞76N-te

6、rt有較強的殺傷能力。MOI=0.01及MOI=0.1的實驗組，感染病毒后第5天，分別有超過85％和95％的細胞已被殺滅；但正常乳腺原代培養(yǎng)細胞不受病毒影響，感染病毒后第5天仍無細胞被殺滅。G47△對乳腺永生化細胞MCF-10A的細胞毒效應較上述腫瘤細胞略輕微，MOI=0.1的實驗組，感染病毒后第5天，僅有24.5％的細胞被殺滅。兩株人乳腺癌細胞MDA-MB-231及ZR-75-1不受病毒影響，感染病毒后第5天仍無細胞被殺滅。被病毒感染

7、的腫瘤細胞可經(jīng)X-gal染色檢測從而證實病毒在細胞內的復制和傳播。在乳腺癌肺轉移模型中，病毒治療組裸鼠平均肺表面結節(jié)數(shù)僅為1，對照組平均肺表面結節(jié)數(shù)為10。
　　 第二部分：溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人鼻咽癌、肝癌、甲狀腺癌的治療作用G47△對人肝癌細胞HEP-G2及HEP-3B有較強的殺傷能力。MOI=0.01及MOI=0.1的實驗組，感染病毒后第5天，分別有超過95％和100％的細胞被殺滅；但人肝癌細胞BEL-7405對G

8、47△的敏感程度較差，MOI=0.1的實驗組，感染病毒后第5天，僅有32.5％的細胞被殺滅。人鼻咽癌細胞CNE2與SUNE1對G47△反應較敏感，MOI=0.01及MOI=0.1的實驗組，感染病毒后第5天，分別有超過85％和95％的細胞被殺滅。人甲狀腺癌細胞對G47△的敏感性略遜于上述細胞，MOI=0.01及MOI=0.1的實驗組，感染病毒后第5天，ARO分別有69.6％和93.9％的細胞被殺滅，F(xiàn)RO分別有33.3％和100％的細胞被

9、殺滅，WRO分別有11.1％和37.8％的細胞被殺滅，KAT-5分別有38.7％和83.9％的細胞被殺滅。在鼻咽癌裸鼠皮下模型中，實驗組病毒治療側腫瘤生長緩慢最終完全消退，對照側及腫瘤組腫瘤生長迅速，于接種后第21天長至18mm。
　　 結論：
　　 近期構建的溶瘤性單純皰疹病毒載體G47△可有效殺傷人乳腺癌細胞、乳腺永生化細胞、鼻咽癌、肝癌及甲狀腺癌細胞，但對正常細胞無影響，尾靜脈注射G47△可有效治療肺轉移乳腺癌，瘤