AGR2對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)行為影響的臨床與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）也稱為大腸癌，是世界第三常見的惡性腫瘤，在男性腫瘤中的發(fā)病率為第三位，在女性中的發(fā)病率為第二位。每年大約有1,000,000例新發(fā)結(jié)直腸癌病例被確診，超過600,000的患者死于該疾病。以外科手術(shù)為主的綜合治療是目前針對(duì)結(jié)直腸癌治療的主要手段，盡管近年來隨著技術(shù)的進(jìn)步和手術(shù)方法的改進(jìn)，使更多原來不能接受根治性手術(shù)的病人完成了根治性外科手術(shù)治療，但是仍有約半數(shù)的患者在進(jìn)行根治性切除術(shù)后

2、5年內(nèi)出現(xiàn)疾病的進(jìn)展。轉(zhuǎn)移一直是結(jié)直腸癌患者治療失敗和引起死亡的最常見原因。而在早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的治療可以有效改善患者的預(yù)后，而且早期預(yù)測轉(zhuǎn)移的發(fā)生對(duì)于制定治療策略至關(guān)重要。因而尋找早期提示腫瘤轉(zhuǎn)移的特異性的生物標(biāo)記物，在結(jié)直腸癌患者的治療中起著舉足輕重的作用。
　　前梯度同源蛋白2（anterior gradient homolog2，AGR2）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與眾多腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，在人類的許多腺癌組織中均

3、呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)。目前諸多研究表明，AGR2表達(dá)的增高與腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移的發(fā)生等病理過程密切相關(guān)。在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、食管癌等惡性腫瘤的癌組織標(biāo)本中均檢測到AGR2呈現(xiàn)高表達(dá)的情況，并且它們的表達(dá)水平的增高與患者的不良預(yù)后相關(guān)。
　　研究發(fā)現(xiàn)，AGR2在消化道粘液分泌細(xì)胞內(nèi)也有大量表達(dá)，主要分布在腸道粘液分泌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可參與腸粘液蛋白MUC2的分泌，在保護(hù)腸粘膜屏障的完整性方面發(fā)揮著重要的作用。

4、　　在結(jié)腸癌的相關(guān)臨床研究中發(fā)現(xiàn)AGR2是結(jié)腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物之一。在結(jié)腸癌患者外周血中的可以檢測到AGR2 mRNA的表達(dá)，結(jié)腸癌患者血清中AGR2 mRNA的表達(dá)水平與結(jié)腸癌浸潤等級(jí)pT3/T4及更高等級(jí)的腫瘤分期相關(guān)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在AGR2 mRNA高表達(dá)水平的患者，其無病生存期明顯降低，即使在腫瘤預(yù)后分期處于較早期的結(jié)直腸癌患者中也是如此。在對(duì)具有相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480及SW620的差異分泌蛋白質(zhì)組

5、的研究中發(fā)現(xiàn)AGR2是具有差異表達(dá)特性的相關(guān)蛋白之一。
　　為了進(jìn)一步研究AGR2基因及其蛋白與結(jié)腸癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，特設(shè)計(jì)本研究：首先檢測 AGR2蛋白在結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，并研究其表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，然后假定AGR2是人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因子；它在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并與結(jié)腸癌的增殖、遷移等惡性行為相關(guān)。使用基因干擾的方法下調(diào)AGR2 mRNA的表達(dá)可以有效

6、抑制結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。由此進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究如下:
　　1.研究AGR2在人結(jié)腸癌組織、正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特點(diǎn)如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度等之間的關(guān)系。
　　2.設(shè)計(jì)并篩選有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 AGR2表達(dá)的si-RNA序列，并構(gòu)建重組慢病毒AGR2 si-RNA(lentivirus-AGR2 si-RNA，LV-AGR-2 si-RNA)表達(dá)載體，并進(jìn)一步篩選出最有效的抑制AGR2mR

7、NA的si-RNA序列。大量復(fù)制后構(gòu)建慢病毒載體，轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，研究靶向AGR2 mRNA的表達(dá)后人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移活性的變化，通過進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力的變化，從細(xì)胞水平探討AGR2對(duì)結(jié)腸癌的生物學(xué)行為的影響。并檢測抑制AGR2 mRNA對(duì)于侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)因子血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF-A及S100A4 mRNA的表達(dá)情況的影響，從分子水平探討AGR2對(duì)結(jié)腸癌的生物學(xué)行為的機(jī)制。
　　3.使用免

8、疫組化法檢測結(jié)腸癌組織病理標(biāo)本中VEGF-A與S100A4蛋白的表達(dá)情況，探討在臨床標(biāo)本 VEGF-A與 S100A4的表達(dá)情況與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤侵犯深度之間的關(guān)系，并進(jìn)一步分別研究在結(jié)腸癌組織中VEGF-A、S100A4與AGR2表達(dá)水平之間的關(guān)系。
　　在實(shí)驗(yàn)中，我們首先研究了 AGR2在人結(jié)腸癌組織、正常結(jié)腸組織的表達(dá)水平及 AGR2的表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。采用免疫組織化學(xué)（Immunohistoch

9、emistry，IHC）方法測定人結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中 AGR2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)合臨床資料分析 AGR2的表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中 AGR2均有表達(dá)，在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較高，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，AGR2蛋白的表達(dá)較未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在不同浸潤程度的結(jié)腸癌病灶中，AGR2蛋白的表達(dá)隨

10、著浸潤程度的加深而增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明：1.AGR2在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著增高，并且在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)。2.隨著結(jié)腸癌組織浸潤程度的加重，AGR2蛋白的表達(dá)水平增高。
　　為了研究 AGR2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。首先設(shè)計(jì)了3個(gè)針對(duì)AGR2靶基因序列的si-RNA序列，分別構(gòu)建重組si-RNA質(zhì)粒，小量包裝si-RNA慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW

11、620中，通過Q-PCR和Western blot方法分別測定轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，比較基因抑制效果，篩選出有效抑制AGR2 mRNA表達(dá)的序列。用所篩選出的si-RNA序列，構(gòu)建重組si-RNA質(zhì)粒，大量包裝LV-AGR2 si-RNA，并檢測病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.Q-PCR檢測3個(gè)si-RNA序列對(duì)AGR2基因的沉默效應(yīng)，其中以Lv-AGR2 si-RNA-1下調(diào)最為明顯(72％)，WB檢測結(jié)果

12、與其一致。2.選擇沉默效應(yīng)為78%的si-RNA序列包裝si-RNA慢病毒載體，測定病毒滴度為4.71*107v.p./ml。通過此階段試驗(yàn)我們成功構(gòu)建慢病毒AGR2 si-RNA表達(dá)載體，可有效下調(diào)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　然后在結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620中通過下調(diào) AGR2 mRNA的表達(dá)來研究靶向抑制AGR2的表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的影響；研究靶向抑制 AGR2后結(jié)腸癌細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的

13、基因S100A4、VEGF-A mRNA和蛋白表達(dá)的變化。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：1.根據(jù)不同處理因素分別將結(jié)腸癌細(xì)胞SW620分為3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入LV-AGR2 si-RNA；陰性對(duì)照組加入無關(guān)序列慢病毒載體；空白對(duì)照組不予任何處理。2.Q-PCR法分別測定各組細(xì)胞AGR2 mRNA的表達(dá)水平。進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測各組細(xì)胞的增殖能力。采用PCR和WB方法分別測定各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)S100A4與VE

14、GF-A mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.AGR2 mRNA的表達(dá)水平：Q-PCR結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)組中AGR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩組對(duì)照組之間相比較無顯著性差異(P>0.05)。提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 LV-AGR2 si-RNA對(duì)細(xì)胞的AGR2基因沉默有效。2.細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTT)：結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長曲線較平緩，細(xì)胞生長速度較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著降低(p<

15、0.05)；陰性對(duì)照組細(xì)胞生長曲線較空白對(duì)照組低平，兩組對(duì)照組之間相比較無顯著性差異(P>0.05)。提示靶向沉默AGR2 mRNA的表達(dá)可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)慢病毒載體本身具有的潛在細(xì)胞毒性。3.侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因S100A4與VEGF-A的mRNA及蛋白表達(dá)水平的測定：結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)組VEGF-A與S100A4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，而兩組對(duì)照組之間相比較無顯著性差異(P>0.

16、05)。WB結(jié)果與PCR一致，提示抑制AGR2基因的表達(dá)后，侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)因子VEGF-A與S100A4表達(dá)水平降低。我們發(fā)現(xiàn)靶向沉默AGR2 mRNA的表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)可以造成與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力有關(guān)的S100A4及 VEGF-A的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。
　　根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及分子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們?cè)谂R床標(biāo)本中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。研究在結(jié)腸癌組織中S100A4、VEGF-A的表達(dá)情況與AGR2表達(dá)之間的關(guān)系

17、。采用免疫組織化學(xué)方法分別測定該組患者結(jié)腸癌組織中S100A4、VEGF-A蛋白的表達(dá)水平，分析 S100A4及 VEGF-A在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的意義，并分析在組織中 S100A4、VEGF-A蛋白表達(dá)情況與 AGR2蛋白表達(dá)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中均有S100A4的表達(dá)，在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中S100A4的表達(dá)增高；AGR2與S100A4在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)是相關(guān)的。VEGF-A并非在所有的結(jié)腸組織中均有表達(dá)，

18、但在結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，在浸潤深度重的患者中 VEGF-A的表達(dá)量較高，AGR2與 VEGF-A在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)關(guān)系尚不明確，仍需進(jìn)一步大樣本研究。組織學(xué)中的研究發(fā)現(xiàn)：1.在結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中均有 S100A4的表達(dá)，S100A4表達(dá)增高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，AGR2與S100A4在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)是相關(guān)的。2. VEGF-A并非在所有的結(jié)腸組織中均有表達(dá)，在結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，在浸潤深度重的患者中VEGF-A的表達(dá)量較高