Axin基因和APC基因片段對結腸癌細胞SW480生物學行為的影響及其機制研究.pdf

1、背景：結直腸癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，在西方國家，其發(fā)病率和死亡率均居第二位。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，90％以上的結直腸癌存在Wnt經(jīng)典信號轉導通路的激活，該通路異常激活的標志是β-catenin的穩(wěn)定和細胞核內的積聚。在結直腸癌細胞中，APC基因的突變?yōu)閣nt通路激活最常見的原因。APC基因體細胞突變多發(fā)生在密碼子1250至1500間，產(chǎn)生截短蛋白，常喪失Axin的結合位點，進而不能有效的降解β-catenin。另一方面，有實驗表

2、明，與APC結合的Axin比Axin自身更能有效地誘導β-catenin的降解。APC和Axin的相互作用在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，將外源性的野生型APC基因導入APC突變的結直腸癌細胞，可導致β-catenin的降解，下調β-catenin的水平。此外，將野生型Axin基因導入APC或Axin突變的結直腸癌細胞亦可導致β-catenin降解及腫瘤細胞凋亡。野生型APC和Axin基因單獨導入結直腸癌細胞已經(jīng)被證實能夠下調

3、β-catenin水平及促進腫瘤細胞凋亡，而將兩者共同導入體內有望取得更強的抑瘤效果但還有待更多的研究證實。由于APC基因全長大于10kb，直接用于基因治療的操作性較困難。本課題組在前期實驗中根據(jù)APC的功能結構域擴增出5條功能片段并構建了5個重組質粒，結果證實攜帶APC5(aa1020-1698)基因片段的重組質粒pEGFP-N3/APC5最能有效降低β-catenin表達且基因片段較小。
　　 目的：建立穩(wěn)定表達APC5的結

4、腸癌細胞株，驗證APC5基因片段是否具有負性調控wnt信號途徑及抑制腫瘤細胞生長的功能，通過研究Axin基因共轉APC5穩(wěn)定細胞株產(chǎn)生的生物學效應，明確APC5基因片段與Axin基因共同作用在體外抑瘤方面是否優(yōu)于APC5單獨作用，為結直腸癌的聯(lián)合基因治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法：(1)對攜帶野生型Axin基因的重組質粒pCS2-MT/Axin和攜帶APC5基因片段的重組質粒進行轉化、提取、雙酶切及測序鑒定。(2)將重組質粒pE

5、GFP-N3/APC5用脂質體介導法轉染入人結腸癌細胞系SW480，經(jīng)過G418篩選，多次采用有限稀釋法連續(xù)克隆化，獲得表達目的基因APC5的穩(wěn)定細胞株。通過觀察細胞克隆中綠色熒光蛋白的表達及Western blot法檢測陽性克隆中標簽蛋白GFP的表達，明確重組質粒轉染后能否在腫瘤細胞中正確表達從而發(fā)揮作用。(3)用MTT法計算穩(wěn)定細胞株的生長抑制率、RT-PCR法檢測重組質粒pEGFP-N3/APC5對wnt信號通路的關鍵分子β-ca

6、tenin及下游靶基因c-myc、survivin和cyclinD1 mRNA表達水平的影響，證實APC5片段是否具有負性調控wnt通路及抑制腫瘤細胞生長的功能。(4)將Axin基因共轉染表達APC5的穩(wěn)定細胞株，通過MTT法計算細胞生長抑制率、RT-PCR檢測wnt通路相關基因mRNA的表達，設表達APC5的穩(wěn)定細胞株作對照。Western blot法檢測wnt通路相關基因蛋白的表達、流式細胞術檢測細胞周期，設APC5單轉組、轉染空載

7、體組及未轉染SW480細胞為對照。使用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：(1)pCS2-MT/Axin經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見一大小約2.5kb的目的片段和4.3kb的載體片段；重組質粒pEGFP-N3/APC5經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約2.0kb的目的片段和一條4.7kb的載體片段，片段大小與預期相符，測序結果正確無誤。(2)pEGFP-N3/A

8、PC5轉染細胞在選擇培養(yǎng)基中長出多個耐藥克隆，所有克隆在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達。western blot法在所有克隆中檢測到標簽蛋白的表達。(3)MTT結果顯示：空載體轉染組和空白對照組的抑制率分別為2.9％和0.0％，兩組穩(wěn)定細胞株SW480/Axin的生長抑制率較大，分別為41.3％和35％，后兩組與前面兩組比較，差異非常顯著(P＜0.01)；Axin共轉染穩(wěn)定細胞株SW480/APC5后，同空載體pCS2-MT共轉SW4

9、80/APC5組（抑制率4.9％）及SW480/APC5組（抑制率0.0％）相比，兩組SW480/APC5-Axin共轉細胞的生長抑制率較大（分別為31.4％,41.7％），差異有顯著性(P＜0.05)。(4)RT-PCR結果：在各組細胞中，瓊脂糖凝膠電泳顯示，分別在約330bp、310bp、300bp、340bp處可見清晰的單一條帶，與目的基因β-catenin、c-myc、survivin和cyclinD1的分子量大小相符。對目的條

10、帶與內參條帶的灰度比值行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。結果顯示：空白SW480細胞和僅轉染空載體pEGFP-N3的SW480細胞之間、兩組SW480/APC5細胞之間RT-PCR電泳條帶灰度比值間的差異無顯著性(p＞0.05)，而后兩組條帶的灰度比值同前相比，比值較小，差異有顯著性(p＜0.05)。Axin共轉染穩(wěn)定細胞株SW480/APC5后，與SW480/APC5-vector組及SW480/APC5組相比，兩組SW480/A

11、PC5-Axin細胞的電泳條帶灰度比值較小，差異有顯著性(p＜0.05)(5)Western blot結果：在各組細胞中，均檢測到特異條帶，與目的基因的分子量大小相符。對Western blot電泳條帶的灰度比值進行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，結果顯示：空白SW480細胞組和SW480/vector-vector組電泳條帶灰度比值之間的差異無顯著性(p＞0.05)；SW480/APC5組電泳條帶灰度比值較小，同前兩組比較，差異有

12、顯著性(P＜0.05)；SW480/APC5-Axin組電泳條帶灰度值最小，同前面三組的任意一組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(6)流式細胞儀細胞周期分析顯示：分別轉染空載體、APC5、APC5-Axin的細胞中，后2種方式的轉染均能引起細胞不同程度滯留于G1/S期。與APC5單基因轉染組相比，共轉染基因組G1/S期比例最大，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：成功建立了穩(wěn)定表達APC5基因片段的人結腸