去甲斑蝥素通過抑制Smad2-3和Snail1影響腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰的共同途徑。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是啟動和維持腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵機(jī)制,也是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機(jī)制。TGF-β/Smads是調(diào)節(jié)EMT和腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵信號通路,Snail是EMT過程和TGF-β/Smads信號通路的關(guān)鍵早期即刻轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子Snail抑制E-cadherin表達(dá),誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞以及腫

2、瘤細(xì)胞的EMT。
   去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)是斑蝥素的重要衍生物,是一種特異性蛋白磷酸酶抑制劑,具有抗腫瘤活性。近期,斑蝥素抗腫瘤作用的研究發(fā)現(xiàn),斑蝥素可通過抑制高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株Smad3和核因子κB(Nuclear Factor-kappa B,NF-κB)p65的表達(dá),降低調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、粘著斑激酶(FAK)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)水平

3、、維持基質(zhì)金屬蛋白酶2/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMP2/TIMP)動態(tài)平衡。我們以往研究首次發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素不僅可以降低蛋白超負(fù)荷腎病大鼠尿蛋白水平,而且還具有抑制腎病大鼠腎組織局部結(jié)締組織生長因子和NF-κBp65的高表達(dá)、改善腎小管間質(zhì)病理損傷、減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。另外,體外實(shí)驗(yàn)顯示去甲斑蝥素可以抑制白蛋白介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞纖維粘連蛋白(Fibronectin,FN)的表達(dá)。但去甲斑蝥素作用的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。
  

4、 基于以上分析,我們認(rèn)為去甲斑蝥素防治腎間質(zhì)纖維化可能與調(diào)節(jié)腎小管EMT有關(guān),為此,本實(shí)驗(yàn)開展如下研究。
   第一章去甲斑蝥素抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究
   目的:利用UUO大鼠模型,初步觀察NCTD對腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響,旨在探討NCTD抑制EMT的作用,闡明NCTD減輕腎纖維化的機(jī)制。
   方法: SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)和UUO+去甲斑蝥素

5、治療組(NCTD組),每組6只。采用單側(cè)(左)輸尿管結(jié)扎方法,建立梗阻性腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型(Ping Xie,Lin Sun,et a1.JASN,2009,Apr;20(4):807-19.),Sham組只游離輸尿管而不結(jié)扎。術(shù)后14天處死動物,取結(jié)扎側(cè)腎臟,同時處死假手術(shù)組大鼠,取出腎組織。采用HE、Masson染色觀察各組之間腎臟病理學(xué)變化,采用RT-PCR及免疫組化、Western blot等方法檢測TGF-β1、E-ca

6、dherin與α-SMA基因和蛋白表達(dá)的變化。
   結(jié)果:光鏡下假手術(shù)組大鼠腎組織無明顯變化,UUO組和NCTD組大鼠腎組織出現(xiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)面積增寬、部分腎小管萎縮、腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性,但是,與模型組比較,NCTD組病變程度減輕。
   RT-PCR、免疫組化及Western blot均顯示,與假手術(shù)組比較,UUO組腎組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)、α-SMA表達(dá)上調(diào)、E-cadheri

7、n表達(dá)下調(diào);與UUO組比較,NCTD組TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào)、α-SMA表達(dá)顯著下調(diào),而E-cadherin表達(dá)上調(diào)。
   結(jié)論:去甲斑蝥素具有減輕UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化和抑制腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用,該作用可能與抑制TGF-β1的過表達(dá)有關(guān)。
   第二章去甲斑蝥素通過下調(diào)信號蛋白Smad2/3、轉(zhuǎn)錄因子Snaill抑制人腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化
   目的:探討去甲斑蝥素對體外人源性近端腎小管細(xì)胞株(H

8、K-2)EMT的影響,研究信號蛋白Smad2/3、轉(zhuǎn)錄因子Snaill在其中的作用。
   方法:常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,分為對照組、TGF-β1組、NCTD組。對照組為無血清DMEM培養(yǎng),TGF-β1組為TGF-β15ng/ml誘導(dǎo),NCTD組為不同濃度NCTD(0.5、1.0、2.5μg/ml)與TGF-β1(5ng/ml)共同作用,各組作用時間48小時。采用RT-PCR、免疫熒光與Western blot分別檢測α-SMA與

9、E-cadherin表達(dá)水平的變化。采用RT-PCR檢測Smad2、Smad3、Snaill mRNA表達(dá),采用Westernblot檢測Smad2/3與Snaill蛋白表達(dá)。選取NCTD2.5μg/ml作用0、15min、30min、60min以及120min不同時間點(diǎn),采用Western blot檢測磷酸化的Smad2/3蛋白表達(dá)變化。
   結(jié)果: RT-PCR、免疫熒光與Western blot均顯示,與對照相比,TGF

10、-β1組α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào);與TGF-β1組相比,NCTD組α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),而E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),且呈一定的劑量依賴關(guān)系。
   RT-PCR和Western blot均顯示,與對照相比,TGF-β1組Smad2、Smad3 mRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)上調(diào),且磷酸化Smad2/3蛋白水平上調(diào);與TGF-β1組比較,N

11、CTD組Smad2、Smad3 mRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)下調(diào),呈劑量依賴性,且磷酸化Smad2/3蛋白水平顯著下降;
  RT-PCR和Western blot均顯示,與對照相比,TGF-β1組SnaillmRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);與TGF-β1組比較,NCTD干預(yù)組SnaillmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),呈劑量依賴性。
   結(jié)論:去甲斑蝥素具有抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT的作用,該作用可能與下調(diào)TGF-β1下游信號蛋白

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