IGF-1對腎小管上皮細胞轉分化作用機制的影響.pdf

1、目的：探討PI3K/Akt通路在IGF-1誘導的人腎小管上皮細胞（human kidney proximal tubular epithelial cell line，HKCs）間質轉分化過程中的作用和意義。
　　方法：用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液將HKCs細胞培養(yǎng)于6孔板或培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至亞融合狀態(tài)，吸棄培養(yǎng)基，換成無血清（free serum medium，F(xiàn)SM）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h

2、，然后分成：①正常對照組：用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞；②IGF-1（50ug/L）組：用50ug/L IGF-1培養(yǎng)細胞；③IGF-1+PI3K/Akt抑制劑LY294002組：用50ug/L IGF-1+15umol/L LY294002培養(yǎng)細胞；按以上分組分別培養(yǎng)24h、48h和72h。免疫印跡法（western blotting）方法檢測a-平滑肌肌動蛋白（a-SMA）、總Akt（t-Akt）和磷酸化Akt（p

3、-Akt）蛋白表達。再按上述方法將細胞分為：①正常對照組；②IGF-1（50ug/L）組；③IGF-1+不同濃度的LY294002（5、15、20umol/L）組，共同培養(yǎng)48h。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法檢測a-SMA和p-Akt mRNA表達水平。DAPI染色法檢測HKCs細胞凋亡的情況。
　　結果：（1）WB結果顯示：隨著IGF-1（50ug/L）作用時間的延長，a-SMA蛋白表達上調

4、（p<0.05），Akt蛋白表達上調（p<0.05），p-Akt蛋白表達上調（p<0.05），且作用呈時間依賴性。（2）與IGF-1（50ug/L）單獨作用于HKCs細胞相比，IGF-1（50ug/L）和LY294002（15umol/L）共同作用后，a-SMA蛋白表達下調（p<0.05），Akt蛋白表達下調（p<0.05），p-Akt蛋白表達下調（p<0.05），且作用呈時間依賴性。（3）IGF-1（50ug/L）作用48h后，RT-

5、PCR結果顯示：a-SMA mRNA表達明顯增加（p<0.05），p-Akt mRNA表達明顯增加（p<0.05）。（4）不同濃度的LY294002均能使p-Akt mRNA表達減少（p<0.05），a-SMA mRNA表達減少（p<0.05），且作用呈濃度依賴性。(5)相差顯微鏡結果顯示：正常對照組細胞呈卵石樣緊密排列生長；IGF-1刺激使HKCs細胞形態(tài)顯著變化，由橢圓形變?yōu)樗笮?，同時促進HKCs細胞增殖；LY294002可阻礙這種

6、變化。(6)DAPI結果顯示：IGF-1能夠抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，而加入不同的LY294002后卻表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)特征，且呈濃度和時間依賴性。
　　結論：（1）IGF-1能誘導HKCs細胞中PI3K/Akt激活，從而促進腎小管上皮細胞轉分化，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展；（2）PI3K/Akt通路參與IGF-1誘導的轉分化過程，PI3K/Akt是IGF-1誘導EMT信號轉導通路中的下游因子之一；（3）PI3K/Akt特異性抑