淋巴細(xì)胞活化與BMMSCs向脂肪分化的相互影響及可能的臨床意義.pdf

1、淋巴細(xì)胞活化與BMMSCs向脂肪分化的相互影響及可能的臨床意義研究背景再生障礙性貧血(再障,AplasticAnemia,AA)發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜,近來(lái)認(rèn)識(shí)到免疫機(jī)制紊亂尤其是淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂在再障發(fā)病中的作用,己成為再障基礎(chǔ)研究方面一個(gè)最活躍的領(lǐng)域。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的起源細(xì)胞細(xì)胞,BMMSCs及其分化成的細(xì)胞在再障發(fā)病過(guò)程中的作用鮮有研究報(bào)

2、道。紅髓脂肪化是再障特征性病理改變。但對(duì)于再障骨髓中的脂肪組織增多原因及作用尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。一直以來(lái),脂肪組織被認(rèn)為是單純的能量?jī)?chǔ)存組織。然而隨著一些脂肪細(xì)胞分泌的因子被人們發(fā)現(xiàn),脂肪細(xì)胞的其他重要生理學(xué)功能被逐漸發(fā)掘出來(lái)。數(shù)十種脂肪細(xì)胞分泌因子(adipocyte-secretedfactors)在近10余年來(lái)已被相繼發(fā)現(xiàn),并引起廣泛重視。這些因子被統(tǒng)稱(chēng)為脂肪細(xì)胞因子(adipocytokines)或簡(jiǎn)稱(chēng)脂肪因子(adipokine

3、s)。目前認(rèn)為脂肪組織是有獨(dú)特組織類(lèi)型,具有特定功能(例如,平衡能量?jī)?chǔ)備、分泌激素和調(diào)節(jié)免疫)的真正器官系統(tǒng)。Leptin和Adiponectin是脂肪組織參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的兩個(gè)主要的脂肪因子。Leptin對(duì)T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都具有免疫調(diào)節(jié)作用。免疫細(xì)胞受到免疫刺激后,產(chǎn)生細(xì)胞因子(尤其是TNF-α)作用于脂肪細(xì)胞,使其分泌Leptin,從而達(dá)到使免疫信號(hào)擴(kuò)大化的目的。Adiponectin是脂肪細(xì)胞表達(dá)最豐的激素。主要在天

4、然免疫效應(yīng)中發(fā)揮作用,能抑制髓單核細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖,抑制巨噬細(xì)胞的活性。因此,與Adiponectin不同,對(duì)于造血免疫系統(tǒng),Adiponectin被看作是一種負(fù)調(diào)控因素,可能參與炎癥反應(yīng)的終止。異常的免疫反應(yīng)可能在損傷造血干細(xì)胞的同時(shí)對(duì)BMMSCs也具有損傷作用,對(duì)BMMSCs的脂肪分化能力產(chǎn)生一定的影響,骨髓內(nèi)顯著增多的脂肪細(xì)胞也可能對(duì)免疫系統(tǒng)有一定的作用。我們對(duì)此進(jìn)行以下研究,以期從一個(gè)新的角度探索再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制。目的(

5、1)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增小鼠BMMSCs,并研究其生物學(xué)特點(diǎn)。(2)培養(yǎng)、擴(kuò)增再障患者和正常對(duì)照BMMSCs,比較兩組BMMSCs生物學(xué)特性及脂肪分化能力的不同。(3)建立免疫相關(guān)骨髓衰竭動(dòng)物模型,觀察免疫紊亂條件下模型小鼠骨髓脂肪化程度的改變,并研究該模型BMMSCs的生物學(xué)特性。(4)研究同基因條件下,活化淋巴細(xì)胞對(duì)BMMSCs向脂肪分化能力的影響及BMMSCs向脂肪細(xì)胞分化后對(duì)單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)增殖及活化狀態(tài)的影響。方法(1)

6、貼壁篩選法分離純化BALB/c小鼠BMMSCs,胰酶消化傳代,FCM鑒定細(xì)胞表型,并在特定誘導(dǎo)劑下誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。(2)體外密度梯度離心法分離培養(yǎng)正常人和再障患者的BMMSCs,觀察其形態(tài)學(xué)的異同,同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其分子表面抗原以及RT-PCR法檢測(cè)成脂肪細(xì)胞的差異。(3)C57BL/6小鼠(父本)和BALB/c小鼠(母本)雜交產(chǎn)生CByB6F1小鼠,將F1小鼠γ射線亞致死量照射(4.5Gy)后尾靜脈注射母本

7、淋巴細(xì)胞,建立免疫相關(guān)骨髓衰竭動(dòng)物模型。記錄白細(xì)胞,紅細(xì)胞,血小板及血紅蛋白的變化,股骨切片HE染色觀察模型小鼠骨髓脂肪化程度,貼壁篩選法分離小鼠BMMSCs,觀察其生物學(xué)特性的改變。(4)將Percoll密度梯分離BALB/c小鼠脾臟MNCs,ConA活化后與BALB/c小鼠BMMSCs共培養(yǎng)72小時(shí),Real-timePCR,WesternBlot及ELISA檢測(cè)BMMSCs脂肪分化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化。BMMSCs誘導(dǎo)分化成脂

8、肪細(xì)胞,與脾MNCs共培養(yǎng)72小時(shí),CCK-8檢測(cè)MNCs增殖,流式檢測(cè)淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志的變化。結(jié)果(1)BMMSCs呈梭形或三角形,長(zhǎng)梭形,細(xì)胞排列整齊,低倍鏡下部分呈平行狀或旋渦狀。流式檢測(cè)BMMSCs高表達(dá)CD44,CD73,CD90和CD105,低表達(dá)或不表達(dá)CD14,CD34,CD45及HLA-DR。在特定的誘導(dǎo)條件下,BMMSCs能向脂肪細(xì)胞,成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。(2)在起始培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)相同條件下,初次換液時(shí)再障患者形成的

9、克隆數(shù)明顯少于正常對(duì)照[(19.3±4.77)/5×10 5MNCsvs(47.72±3.46)/5×10 5MNCs,(P<0.05)],再障組和正常對(duì)照BMMSCs細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志無(wú)明顯差別,體外再障患者BMMSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化較正常組早。(3)CByB6F1小鼠亞致死量照射后,骨髓衰竭為可逆性,外周血象在第10天開(kāi)始恢復(fù),約6周恢復(fù)至正常水平,而亞致死量照射后經(jīng)尾靜脈注射母本小鼠淋巴細(xì)胞的小鼠,外周血象降低為不可逆性,造成

10、不可逆性免疫相關(guān)骨髓衰竭。骨髓病理學(xué)檢查證實(shí)骨髓衰竭,免疫相關(guān)骨髓衰竭組小鼠髓腔空虛,脂肪組織明顯增多,而正常對(duì)照組和單獨(dú)照射組骨髓內(nèi)均無(wú)明顯脂肪組織形成。體外培養(yǎng)證實(shí),與對(duì)照組相比,免疫相關(guān)骨髓衰竭組小鼠BMMSCs增殖能力降低,不能傳代。(4)體外培養(yǎng),BALB/c小鼠BMMSCs與經(jīng)ConA活化的BALB/c小鼠脾臟的MNCs按1:5比例共培養(yǎng)72小時(shí),Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BMMSCs的Leptin基因表達(dá)明顯增加而

11、Adiponectin基因表達(dá)輕度降低,WesternBlot檢測(cè)該兩種蛋白表達(dá)也有近似的趨勢(shì)。ELISA定量檢測(cè)共培養(yǎng)上清中這兩種蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Leptin低于檢測(cè)下限而Adiponectin則明顯減少。將BALB/c小鼠的脾MNCs與其BMMSCs或脂肪分化的BMMSCs按一定比例共培養(yǎng),BMMSCs:MNCs為1:0.5時(shí),脂肪分化的BMMSCs組的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用顯著低于正常對(duì)照組BMMSCs[正常對(duì)照組vs脂肪分化組為-

12、(77.8±20.7)％vs-(47.8±14.3)%,(P<0.05)];而其比例相當(dāng)(BMMSCs:淋巴細(xì)胞為1:1)時(shí),脂肪分化的BMMSCs組對(duì)淋巴細(xì)胞的作用為輕度促增殖,但與正常對(duì)照組的輕度抑制增殖作用相比,差異無(wú)顯著性[正常對(duì)照組vs脂肪分化組為-(28.3±5.2)%vs(3.3±4.9)%,(P>005)];當(dāng)淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,超過(guò)BMMSCs數(shù)量時(shí),脂肪化的BMMSCs組就表現(xiàn)為促淋巴細(xì)胞增殖作用[正常對(duì)照組vs脂

13、肪分化組為1:2.5時(shí)(-3.9±8.3)%vs(34.2±17.1)%,(P<0.05);1:5時(shí)(9.4±8.8)%vs(40.8±16.3)%(P<0.05);1:10時(shí)(20±14.9)%vs(65.8±12.5)%(P<0.05)],而且該作用在一定比例范圍內(nèi),隨著淋巴細(xì)胞數(shù)量的增多而逐漸增強(qiáng)。脂肪分化的BMMSCs與MNCs共培養(yǎng)72h后,卻能使淋巴細(xì)胞的活化標(biāo)志CD25和CD69表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯增增加[脂肪分化BM

14、MSCs共培養(yǎng)組vs正常BMMSCs共培養(yǎng)組:CD25+(50.9±7.7)%vs(16.2±5.7)%,(P<0.05);CD69+(47.3±5.8)%vs(13.3±4.6)%(P<0.05)]。結(jié)論(1)全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法可簡(jiǎn)便、高效分離、純化BMMSCs。所獲得的細(xì)胞具有BMMSCs特征性的細(xì)胞表型及向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化能力。(2)再障患者BMMSCs形態(tài)與正常對(duì)照相比無(wú)明顯變化,但其增殖能力較正常對(duì)照降低,而

15、且脂肪細(xì)胞分化早于正常對(duì)照。(3)CByB6F1小鼠在亞致死量照射后,骨髓衰竭為可逆性,經(jīng)尾靜脈注射母本小鼠淋巴細(xì)胞可誘導(dǎo)不可逆性骨髓衰竭,形成免疫相關(guān)骨髓衰竭動(dòng)物模型,模型動(dòng)物骨髓脂肪組織明顯增多,BMMSCs增殖能力降低,不能傳代,對(duì)照組卻無(wú)此種改變。(4)ConA活化的淋巴細(xì)胞能促進(jìn)BMMSCs脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá),且脂肪因子分泌失調(diào),Leptin增加而Adiponectin減少。當(dāng)BMMSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞后,與MNCs共