右歸丸及其有效成分對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺T淋巴細(xì)胞異常分化的保護(hù)機(jī)制.pdf

1、目的： 激素可通過內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)對機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生廣泛影響。其中，T細(xì)胞各亞群在胸腺的分化發(fā)育和在外周淋巴器官的功能體現(xiàn)均對體內(nèi)激素水平的變化表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。由應(yīng)急反應(yīng)或作為藥物治療所引起的糖皮質(zhì)激素水平升高可嚴(yán)重影響T細(xì)胞在胸腺的分化發(fā)育過程，也因此成為多種免疫相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。中藥在治療多種免疫相關(guān)疾病的長期實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，在臨床療效顯著的中藥經(jīng)典方劑中探討右歸丸及其有效成分對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)

2、的胸腺T細(xì)胞異常分化的調(diào)控機(jī)制及其效應(yīng)靶點(diǎn)是研究的主要目的。 方法： 1.建立糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺T細(xì)胞異常分化的小鼠模型 2.觀察右歸丸對模型小鼠胸腺T細(xì)胞異常分化的保護(hù)作用 3.觀察部分單體有效成分(梓醇、烏頭堿)對小鼠胸腺T細(xì)胞各亞群分化(CD4+SP，CD8+SP，CD4+CD8+DP)及對外周T細(xì)胞庫各亞群補(bǔ)充能力(CD3+CD4+CD45RA+CD11adim，CD3+CD8+CD45RA+CD

3、11adim)的調(diào)節(jié)作用 4.采用AnnexinV/PI雙染法觀察胸腺T細(xì)胞凋亡狀態(tài) 5.采用RT-PCR及Real-timePCR法檢測胸腺細(xì)胞bcl-2，bax，caspase-3，8，9等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺細(xì)胞及外周T細(xì)胞庫各亞群表面分子的表達(dá)水平 7.采用CFSE染色法體外觀察糖皮質(zhì)激素及右歸丸對胸腺細(xì)胞增殖的影響 8.幼鼠長期飲用右歸丸制劑，觀察其對生理性胸腺

4、萎縮的保護(hù)效應(yīng) 結(jié)果： 1.糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺T淋巴細(xì)胞的過度凋亡及其機(jī)制 經(jīng)不同劑量的糖皮質(zhì)激素處理后，在藥理劑量范圍內(nèi)即可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞的過度凋亡，其早期凋亡和晚期凋亡比例明顯高于正常對照組。 PCR結(jié)果顯示：bcl-2mRNA的相對表達(dá)量與正常對照組比較下降59.01％，而bax的相對表達(dá)量升高，bcl-2/bax比值顯著下降，使正常狀態(tài)下bcl-2/bax的平衡模式被打破。從而導(dǎo)致凋亡信號caspa

5、se3，caspase8，caspase9的表達(dá)水平明顯升高，F(xiàn)as表達(dá)水平變化沒有顯著差異。 2.糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺T淋巴細(xì)胞的異常分化 經(jīng)不同劑量的糖皮質(zhì)激素處理后，胸腺細(xì)胞各亞群細(xì)胞比例發(fā)生異常變化：首先，CD4+CD8+DP細(xì)胞比例隨著糖皮質(zhì)激素水平升高急劇下降，由～69％逐步下降到～15％，激素對胸腺DP的損傷有明顯的劑量依賴性：同時，胸腺細(xì)胞CD4+SP，CD8+SP比例失衡，CD4+SP/CD8+SP比值由

6、正常的1.5～2:1變?yōu)?～4:1。 3.右歸丸對激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞異常分化的保護(hù)作用 右歸丸聯(lián)合激素處理后，伴隨著胸腺指數(shù)和胸腺細(xì)胞數(shù)的改善，胸腺DP比例下降趨勢發(fā)生逆轉(zhuǎn)。另外，CD4+和CD8+SP比例雖然與HC處理組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但由于胸腺細(xì)胞總數(shù)的升高，CD4+SP和CD8+SP絕對計(jì)數(shù)明顯升高。這一結(jié)果說明，右歸丸同步治療對激素導(dǎo)致的胸腺細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，其中，對胸腺DP的保護(hù)作用最為明顯。同時，右歸

7、丸的同步干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞過度凋亡，尤其對胸腺細(xì)胞早期凋亡有明顯的改善作用。 PCR結(jié)果顯示：右歸丸的同步干預(yù)可使bcl-2mRNA的相對表達(dá)量明顯高于激素組(P＜0.05)，baxmRNA的相對表達(dá)量雖無明顯改變，但bcl-2/baxmRNA比值明顯增高(1.35vs0.37，P＜0.05)，使激素誘導(dǎo)的bcl-2/bax平衡失調(diào)現(xiàn)象得到逆轉(zhuǎn)，此時caspase3，8，9的高表達(dá)狀態(tài)也得到抑制。 4.右歸

8、丸體外對激素誘導(dǎo)的胎鼠胸腺細(xì)胞低增殖狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)效應(yīng) CFSE染色結(jié)果顯示：胸腺細(xì)胞經(jīng)激素體外處理48h后，增殖細(xì)胞所占的比例(2.2％)與對照組(4.0％)相比明顯下降，而右歸丸依據(jù)對胸腺細(xì)胞體外增殖的直接刺激作用(4.8％vs4.0％)，可明顯逆轉(zhuǎn)激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞低增殖狀態(tài)(2.8％vs2.2％) 5.右歸丸部分有效成分對胸腺細(xì)胞分化的直接作用 流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，烏頭堿腹腔注射對小鼠胸腺有輕微損傷，但沒有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)差異。胸腺CD4+SP雖沒有顯著變化，但胸腺CD8+SP顯著下降，導(dǎo)致CD4/CD8比值明顯高于同步對照組(3.27vs1.772，P＜0.05)，其作用沒有明顯的時間依賴性差異。 腹腔注射梓醇對小鼠胸腺有明顯保護(hù)作用(P＜0.05)，伴隨胸腺指數(shù)和胸腺細(xì)胞數(shù)的升高，胸腺CD8+SP絕對計(jì)數(shù)明顯升高，而CD4+SP絕對計(jì)數(shù)相對減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其CD4+/C08+比值明顯低于同步對照組(1.84vs3.11)，同時，胸腺

10、DP細(xì)胞比例明顯升高(4.78vs3.43×106)，其作用具有明顯的劑量依賴性。 6.右歸丸對生理性胸腺萎縮的保護(hù)作用 幼鼠飲用右歸丸制劑120天后，胸腺系數(shù)、胸腺細(xì)胞數(shù)與正常組比較均明顯升高，但胸腺細(xì)胞各亞群比例沒有顯著變化。與此同時，外周CD3+T細(xì)胞明顯升高(84％vs71％)，并且初始T細(xì)胞(CD3+CD45RA+CD11adim)比例也明顯上調(diào)，其中CD45RA+CD11adimCD8+細(xì)胞占據(jù)初始T細(xì)胞的優(yōu)

11、勢。伴隨著外周淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的明顯升高，初始T細(xì)胞特別是CD8+初始T細(xì)胞的優(yōu)勢更為突出，說明右歸丸可明顯提高外周淋巴組織T細(xì)胞庫中初始T細(xì)胞數(shù)量和比例，進(jìn)一步驗(yàn)證了右歸丸改善胸腺細(xì)胞分化狀態(tài)后對外周T細(xì)胞庫補(bǔ)充能力的提高。 結(jié)論： 右歸丸通過改善激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞過凋亡有效保護(hù)激素誘導(dǎo)的胸腺T細(xì)胞異常分化，同時提高胸腺對外周T細(xì)胞庫的補(bǔ)充能力，提示右歸丸制劑具有抗T細(xì)胞免疫衰老的作用。這可能是右歸丸作為免疫增強(qiáng)劑臨床用于