胸腺對(duì)胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化過(guò)程中不同階段細(xì)胞MHC表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　研究胸腺上皮細(xì)胞對(duì)胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的各個(gè)階段細(xì)胞MHC分子表達(dá)的影響，努力尋找一種能降低胚胎干細(xì)胞來(lái)源的成熟細(xì)胞免疫原性的方法，為干細(xì)胞移植治療抗移植排斥策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的制備:取e13.5天的孕小鼠，用75％酒精消毒后充分剪碎(1-3mm3)，再用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA溶液消化成細(xì)胞懸液，制備成小鼠胚胎成

2、纖維細(xì)胞(MEF)。
　　2.胚胎干細(xì)胞(ESC)的擴(kuò)增:小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)接種于經(jīng)絲裂霉素處理的飼養(yǎng)層MEF上，在含15％胎牛血清、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3-4天按1:3-4比例傳代擴(kuò)增一次。
　　3.ESC向IPC分化誘導(dǎo):
　　3.1擬胚體(embryonic bodies，EB)的形成:將培養(yǎng)3-4天的ESC用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％E

3、DTA消化為單細(xì)胞后，接種子低粘附性的細(xì)菌培養(yǎng)皿，懸浮培養(yǎng)4-5天，使ESC自發(fā)分化為EB。
　　3.2 nestin陽(yáng)性細(xì)胞(nestin positive cells，NPC)的形成:收集培養(yǎng)4-5天的EB，轉(zhuǎn)接于Ⅰ型膠原蛋白包被過(guò)的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24小時(shí)，EB貼壁后更換為無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，添加N2、纖維連接蛋白、bFGF。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3天可形成NPC。
　　3.3胰島素分泌細(xì)胞(insulin-prod

4、ucing cells，IPC)的形成:NPC形成后，更換為含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、活化素-A、β-細(xì)胞素、煙酰胺、bFGF和不含血清的DMEM/F12的IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，至第4天，培養(yǎng)液中添加10mmol/L濃度的葡萄糖，24小時(shí)后更換為含葡萄糖20mmol/L的新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至IPC形成并聚集為胰島樣細(xì)胞團(tuán)（islet-like cell clusters，ICCs）。
　　4.小鼠胸腺上皮細(xì)胞的分離:

5、　　(1)酶消化法:無(wú)菌取小鼠胸腺，充分剪碎(1-3mm3)，加0.25％胰蛋白酶消化液，37℃水浴，離心，棄上清，加0.2％膠原酶，37℃水浴，棄上清，用比重為1.077的細(xì)胞分離液分離，取第二條條帶接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24小時(shí)后，第一次換液，以后每3天換一次液。細(xì)胞經(jīng)HE染色和免疫組化染色鑒定。
　　(2)組織快法:取小鼠胸腺組織，剪碎，直接放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加適量培養(yǎng)液培養(yǎng)，3天后換液，待上皮細(xì)胞爬滿(mǎn)瓶后，可傳代凍存。細(xì)

6、胞經(jīng)HE染色和免疫組化染色鑒定。
　　5.小鼠胸腺細(xì)胞上清的制各:無(wú)菌取胸腺組織，剪碎，酶消化，中和離心后，直接將細(xì)胞以1×106/ml接種到培養(yǎng)瓶。8小時(shí)后收集瓶中懸浮細(xì)胞（去除貼壁的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞），離心后將細(xì)胞重懸，以1×106/ml細(xì)胞密度加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)（排除血清中未知因子對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾），培養(yǎng)24小時(shí)收集細(xì)胞懸液，離心后去細(xì)胞，取上清液保存?zhèn)溆谩?br>　　6.胸腺上皮細(xì)胞與EB共培養(yǎng)及ES向IPC定向分化的

7、誘導(dǎo):ESC培養(yǎng)3-4天后，轉(zhuǎn)接于用胸腺上皮細(xì)胞包被過(guò)的培養(yǎng)瓶，誘導(dǎo)培養(yǎng)至ICC形成。
　　7.共培養(yǎng)各階段免疫原性檢測(cè):與胸腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的EB、NPC、IPC和ICC，用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體處理后流式細(xì)胞儀(FCM)分析，檢測(cè)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達(dá)情況。
　　8.胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)EB向IPC分化及MHC表達(dá)的影響:ESC培養(yǎng)3-4天后，等量接入用Ⅰ型膠原蛋白包被過(guò)的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶分三組，分別加入20％

8、、40％和60％的胸腺細(xì)胞上清液，誘導(dǎo)至ICC形成。
　　9.條件培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞各階段免疫原性檢測(cè):添加胸腺細(xì)胞上清的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的EB、NPC、IPC和ICC，用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體處理后流式細(xì)胞儀(FCM)分析，檢測(cè)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)?zāi)塬@得增殖能力旺盛及純化的MEF飼養(yǎng)層。采用MEF和LIF相結(jié)合的方法培養(yǎng)ESC，ESC擴(kuò)增能力強(qiáng)，能長(zhǎng)時(shí)間維持干細(xì)胞特性。

9、>　　2.實(shí)驗(yàn)采用分階段誘導(dǎo)方法，在胸腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，ESC也可以正常誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)。
　　3.在胸腺上皮細(xì)胞分離時(shí)，采用酶消化法在細(xì)胞培養(yǎng)4天后可見(jiàn)少量上皮細(xì)胞。組織塊法培養(yǎng)一周左右，組織塊周?chē)莱龃罅可掀ぜ?xì)胞?？棄K法比酶消化法方便簡(jiǎn)單，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)能獲取更多的胸腺上皮細(xì)胞。
　　4.經(jīng)HE染色和免疫組化染色，胸腺上皮細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)不一，呈三角或多角形，彼此緊密相接呈鋪磚樣排列，免疫組化CK8蛋白著色的陽(yáng)

10、性部位位于胞質(zhì)區(qū)。
　　5.EB與胸腺上皮細(xì)胞或不同濃度的胸腺細(xì)胞上清共培養(yǎng)后，隨著分化的不同階段，MHC-1和MHC-Ⅱ分子表達(dá)都逐漸降低。
　　結(jié)論:
　　1.EB與胸腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)不影響EB向胰島樣細(xì)胞團(tuán)分化。
　　2.在與胸腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)中，和對(duì)照組相比，MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達(dá)在EB、NPC階段較高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在IPC、ICC階段MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達(dá)比對(duì)照組低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義，故認(rèn)