比較蛋白質組學研究大鼠感覺與運動神經(jīng)差異表達蛋白.pdf

1、目的：采用相對和絕對定量的等量異位標簽(iTRAQ)偶聯(lián)在線二維液相色譜串聯(lián)質譜(2D LC-MS/MS)的定量蛋白質組學技術，建立大鼠感覺與運動神經(jīng)的全蛋白質組表達譜，通過定量分析得到差異表達蛋白；采用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫和PubMed等生物信息學工具對全蛋白表達譜和差異表達蛋白根據(jù)生物學功能進行分類。從蛋白水平分析感覺與運動神經(jīng)功能差異的物質基礎，并為進一步深入探討感覺與運動神經(jīng)特異性再生的機制提供科學依據(jù)。
　　方法：<

2、br>　　1、根據(jù)解剖學結構分離感覺與運動神經(jīng)，取材備用；提取蛋白樣品，采用Bradford法測定總蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白樣品的質量。
　　2、蛋白樣品經(jīng)過丙酮沉淀，酶解，iTRAQ標記后，使用AnalystTM1.1軟件控制Nano-HPLC system和hybrid Q-TOF mass spectrometer(QSTAR XL)并采集數(shù)據(jù)。
　　3、通過ProteinPilotTM4.0軟件鑒

3、定并定量多肽和蛋白質。
　　4、蛋白質組學分析中獲得的全蛋白表達譜和差異表達蛋白通過檢索 Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫和PubMed數(shù)據(jù)庫，根據(jù)其生物學功能進行分類。
　　5、通過Western blot和qRT-PCR方法分別對感覺與運動神經(jīng)差異表達蛋白及基因進行驗證。
　　6、通過免疫組化染色對感覺與運動神經(jīng)差異表達蛋白進行定位分析。
　　結果：
　　1、根據(jù)解剖學結構，成功獲得感覺與運動神經(jīng)。SDS-PA

4、GE電泳的結果顯示感覺與運動神經(jīng)蛋白樣品品質較佳。
　　2、經(jīng) ProteinPilotTM4.0軟件分析，獲得感覺與運動神經(jīng)全蛋白質組表達譜。以蛋白置信度>95％或ProtScore>1.3為限，共鑒定了1472個非冗余蛋白，并根據(jù)生物學功能分類。
　　3、蛋白質組學檢測的1472個非冗余蛋白以90%可信區(qū)間計算117/116（感覺神經(jīng)/運動神經(jīng)）的比值，比值≥2.0237的為感覺神經(jīng)高表達蛋白；≤0.5010的為運動神經(jīng)

5、高表達蛋白。結果發(fā)現(xiàn)有100個顯著差異表達蛋白，其中56個為感覺神經(jīng)高表達、運動神經(jīng)低表達蛋白，44個為運動神經(jīng)高表達、感覺神經(jīng)低表達蛋白。
　　4、56個感覺神經(jīng)高表達蛋白根據(jù)生物學功能分類，其中40個可以分為以下10類，包括：細胞粘附蛋白、肌動蛋白結合蛋白、鈣結合蛋白、信號轉導蛋白、神經(jīng)元可塑性調節(jié)蛋白、酶、脂代謝蛋白、DNA結合蛋白、SNAP復合體蛋白和ATP結合蛋白，其余16個歸為雜類和未鑒定蛋白。
　　5、44個運

6、動神經(jīng)高表達蛋白根據(jù)生物學功能分類，其中35個可以分為以下12類，包括：細胞骨架蛋白、細胞外基質分子、氧化還原通路相關蛋白、神經(jīng)營養(yǎng)因子、肌動蛋白結合蛋白、信號轉導蛋白、轉運蛋白、鈣結合蛋白、酶、酶抑制劑、脂代謝蛋白和ATP結合蛋白，其余9個歸為雜類和未鑒定蛋白。
　　6、通過qRT-PCR分別對100個差異表達蛋白中的20個感覺神經(jīng)高表達蛋白與14個運動神經(jīng)高表達蛋白進行驗證，結果與蛋白質組學的檢測一致。
　　7、 Wes

7、tern blot結果顯示CALB2，CNPase和SNAP-25在感覺神經(jīng)中高表達， CNTF，NFh，NES和VIM在運動神經(jīng)中高表達，結果與蛋白質組學的檢測一致。
　　8、免疫組化結果顯示CNPase，NCAM1和L1與施萬細胞的標記物S100共定位；CALB2和SNAP-25既與神經(jīng)元標記物NF200共定位，也與施萬細胞的標記物S100共定位。提示CNPase，NCAM1和L1的差異表達由施萬細胞產(chǎn)生，而CALB2和SNA

8、P-25的差異表達既由神經(jīng)元，也由施萬細胞產(chǎn)生。
　　結論：
　　1、通過iTRAQ偶聯(lián)2D LC-MS/MS的定量蛋白質組學技術，在建立大鼠感覺與運動神經(jīng)的全蛋白質組表達譜的基礎上，通過定量分析得到100個差異表達蛋白，其中56個為感覺神經(jīng)高表達、運動神經(jīng)低表達蛋白，44個為運動神經(jīng)高表達、感覺神經(jīng)低表達蛋白。
　　2、采用生物信息學工具對所鑒定的差異表達蛋白進行功能分類，發(fā)現(xiàn)主要涉及細胞粘附蛋白、鈣結合蛋白、脂代謝