比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究大鼠感覺與運(yùn)動神經(jīng)差異表達(dá)蛋白.pdf

1、目的：采用相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽(iTRAQ)偶聯(lián)在線二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立大鼠感覺與運(yùn)動神經(jīng)的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，通過定量分析得到差異表達(dá)蛋白；采用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫和PubMed等生物信息學(xué)工具對全蛋白表達(dá)譜和差異表達(dá)蛋白根據(jù)生物學(xué)功能進(jìn)行分類。從蛋白水平分析感覺與運(yùn)動神經(jīng)功能差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步深入探討感覺與運(yùn)動神經(jīng)特異性再生的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：<

2、br>　　1、根據(jù)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分離感覺與運(yùn)動神經(jīng)，取材備用；提取蛋白樣品，采用Bradford法測定總蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白樣品的質(zhì)量。
　　2、蛋白樣品經(jīng)過丙酮沉淀，酶解，iTRAQ標(biāo)記后，使用AnalystTM1.1軟件控制Nano-HPLC system和hybrid Q-TOF mass spectrometer(QSTAR XL)并采集數(shù)據(jù)。
　　3、通過ProteinPilotTM4.0軟件鑒

3、定并定量多肽和蛋白質(zhì)。
　　4、蛋白質(zhì)組學(xué)分析中獲得的全蛋白表達(dá)譜和差異表達(dá)蛋白通過檢索 Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫和PubMed數(shù)據(jù)庫，根據(jù)其生物學(xué)功能進(jìn)行分類。
　　5、通過Western blot和qRT-PCR方法分別對感覺與運(yùn)動神經(jīng)差異表達(dá)蛋白及基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　6、通過免疫組化染色對感覺與運(yùn)動神經(jīng)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行定位分析。
　　結(jié)果：
　　1、根據(jù)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，成功獲得感覺與運(yùn)動神經(jīng)。SDS-PA

4、GE電泳的結(jié)果顯示感覺與運(yùn)動神經(jīng)蛋白樣品品質(zhì)較佳。
　　2、經(jīng) ProteinPilotTM4.0軟件分析，獲得感覺與運(yùn)動神經(jīng)全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。以蛋白置信度>95％或ProtScore>1.3為限，共鑒定了1472個非冗余蛋白，并根據(jù)生物學(xué)功能分類。
　　3、蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的1472個非冗余蛋白以90%可信區(qū)間計算117/116（感覺神經(jīng)/運(yùn)動神經(jīng)）的比值，比值≥2.0237的為感覺神經(jīng)高表達(dá)蛋白；≤0.5010的為運(yùn)動神經(jīng)

5、高表達(dá)蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有100個顯著差異表達(dá)蛋白，其中56個為感覺神經(jīng)高表達(dá)、運(yùn)動神經(jīng)低表達(dá)蛋白，44個為運(yùn)動神經(jīng)高表達(dá)、感覺神經(jīng)低表達(dá)蛋白。
　　4、56個感覺神經(jīng)高表達(dá)蛋白根據(jù)生物學(xué)功能分類，其中40個可以分為以下10類，包括：細(xì)胞粘附蛋白、肌動蛋白結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)蛋白、酶、脂代謝蛋白、DNA結(jié)合蛋白、SNAP復(fù)合體蛋白和ATP結(jié)合蛋白，其余16個歸為雜類和未鑒定蛋白。
　　5、44個運(yùn)

6、動神經(jīng)高表達(dá)蛋白根據(jù)生物學(xué)功能分類，其中35個可以分為以下12類，包括：細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)分子、氧化還原通路相關(guān)蛋白、神經(jīng)營養(yǎng)因子、肌動蛋白結(jié)合蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鈣結(jié)合蛋白、酶、酶抑制劑、脂代謝蛋白和ATP結(jié)合蛋白，其余9個歸為雜類和未鑒定蛋白。
　　6、通過qRT-PCR分別對100個差異表達(dá)蛋白中的20個感覺神經(jīng)高表達(dá)蛋白與14個運(yùn)動神經(jīng)高表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測一致。
　　7、 Wes

7、tern blot結(jié)果顯示CALB2，CNPase和SNAP-25在感覺神經(jīng)中高表達(dá)， CNTF，NFh，NES和VIM在運(yùn)動神經(jīng)中高表達(dá)，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測一致。
　　8、免疫組化結(jié)果顯示CNPase，NCAM1和L1與施萬細(xì)胞的標(biāo)記物S100共定位；CALB2和SNAP-25既與神經(jīng)元標(biāo)記物NF200共定位，也與施萬細(xì)胞的標(biāo)記物S100共定位。提示CNPase，NCAM1和L1的差異表達(dá)由施萬細(xì)胞產(chǎn)生，而CALB2和SNA

8、P-25的差異表達(dá)既由神經(jīng)元，也由施萬細(xì)胞產(chǎn)生。
　　結(jié)論：
　　1、通過iTRAQ偶聯(lián)2D LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在建立大鼠感覺與運(yùn)動神經(jīng)的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，通過定量分析得到100個差異表達(dá)蛋白，其中56個為感覺神經(jīng)高表達(dá)、運(yùn)動神經(jīng)低表達(dá)蛋白，44個為運(yùn)動神經(jīng)高表達(dá)、感覺神經(jīng)低表達(dá)蛋白。
　　2、采用生物信息學(xué)工具對所鑒定的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)主要涉及細(xì)胞粘附蛋白、鈣結(jié)合蛋白、脂代謝