rhIL-24質(zhì)粒的構(gòu)建及rhDCN聯(lián)合rhIL-24對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞影響的體外研究.pdf

1、目的：探討核心蛋白聚糖(DCN)基因聯(lián)合白介素-24(IL-24)基因在體外對(duì)PBMC功能的影響。
　　 方法：⑴構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24。經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定基因序列，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH-5α中，大量提取pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24重組質(zhì)粒；⑵利用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL

2、-24轉(zhuǎn)入PBMC，鑒定轉(zhuǎn)染效率，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCN和IL-24的mRNA表達(dá)；⑶測(cè)定重組質(zhì)粒對(duì)PBMC的影響：MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PBMC的增殖、ELISA測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞IFN-r分泌水平、流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)PBMC表面PD-1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切及PCR鑒定后，所得的基因片段與預(yù)期的基因片段大小相符；經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)：序列與GenBank中IL-24的序列一致；②

3、通過(guò)脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)轉(zhuǎn)入PBMC后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有DCN和IL-24的mRNA表達(dá)；③MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染后96h、120h、144h，DCN與IL-24聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率明顯高于DCN組，IL-24組，空質(zhì)粒組，空白對(duì)照組，脂質(zhì)體組；ELISA顯示：DCN與IL-24聯(lián)合組分泌IFN-γ的量顯著高于其他組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)顯示：PD-1受