維甲酸誘導(dǎo)Ⅰ在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其免疫學(xué)機制.pdf

1、缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的概念由Jennings于1960年首次提出，指缺血的組織器官重新獲得血液供應(yīng)后，組織、器官功能并沒有得以恢復(fù)，其功能代謝障礙及組織結(jié)構(gòu)破壞程度反而加重的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷是常見的臨床病理現(xiàn)象，涉及機體創(chuàng)傷與失血性休克、心臟冠狀動脈缺血、心臟體外循環(huán)手術(shù)、肝臟部分切除術(shù)以及肝、腎臟等器官移植手術(shù)等，可嚴重影響疾病的預(yù)后，但由于對IRI發(fā)生的分子機制仍然缺乏

2、深刻的了解，限制了臨床防治方法的有效實施。特別是肝、腎、心臟等臟器移植過程中器官的獲取和移植過程中產(chǎn)生的IR損傷可導(dǎo)致移植物無功能或功能延遲恢復(fù)，并增加移植物急、慢性排斥的發(fā)生率，影響移植物的中遠期存活率，因此，如何有效的減輕IR損傷，以及更好的保護供體器官，都是亟待解決的研究課題。IR損傷的機制復(fù)雜，分為缺血、再灌注二個過程;缺血過程中由于缺氧后線粒體功能受損及ATP耗竭，造成能量代謝障礙、鈣超載以及細胞凋亡等為主的損傷;再灌注后主要

3、涉及到氧自由基釋放造成蛋白和核酸的損傷，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及凋亡損傷的進一步加重。近年來，隨著天然免疫產(chǎn)生機制的認識，模式識別受體(Patternrecognition receptors，PRRs)對病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecularpattern，PAMP)識別機制也適用于對損傷相關(guān)的分子模式(DMAP: damge associatedmolecule pattern)的識別，從而認識到在肝臟

4、IR過程中，缺血缺氧所致的直接損傷使受損細胞釋放內(nèi)源性配體或危險信號(HMGB-1、HSP、尿酸、纖維蛋白原等)，激活肝細胞或非實質(zhì)細胞表面的模式識別受體，從而啟動天然免疫反應(yīng)，介導(dǎo)進一步的損傷。由此可見，模式識別受體及其信號通路在肝臟IR的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。然而，前期研究均集中在Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)和相關(guān)的信號通路，而另一種重要的模式識別受體: RLRs(Retinoic-acid-

5、inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-likereceptors，RLRs）是否在肝臟IR損傷過程中也發(fā)揮作用并未受到關(guān)注。研究表明，RLRs所介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)在機體抵抗病毒感染的天然免疫過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，其中又以維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（Retinoic-acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ）為最具代表性的分子，其是否在肝臟IR損傷過程中發(fā)揮作用以及如何發(fā)揮作用的機制值得探究。
　　 RIG-Ⅰ又稱DDX

6、58A，包含925個氨基酸殘基，屬于DExD/H家族，主要分布在胞質(zhì)中。RIG-Ⅰ主要識別并直接結(jié)合5'端磷酸化的病毒RNA，與其受體MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)、IPS-1(IFN-βpromoter stimulator1)或Cardif（CARD adaptor inducing IFN-β）結(jié)合，通過活化NF-κB和IRF3/7，引起Ⅰ型干擾素分泌上調(diào)，介導(dǎo)抗病毒

7、免疫應(yīng)答。然而，機體自身表達的RNA最初也有5'端的磷酸化修飾，盡管在正常情況下機體自身來源的RNA均不會在胞漿中激活RIG-Ⅰ信號。但是，當細胞壞死釋放核內(nèi)物質(zhì)的時候，其中是否包括RIG-Ⅰ的配體？RIG-Ⅰ信號通路是否也如同TLRs一樣參與肝臟IR的介導(dǎo)？目前尚無相關(guān)的研究報道。
　　 基于此，我們在本課題中研究了RIG-Ⅰ與肝臟IR之間的相互關(guān)系及其對肝臟IR損傷調(diào)控的相關(guān)機制。
　　 一、肝臟IR對RIG-Ⅰ表達

8、的影響及可能機制
　　 為了探討肝臟IR對RIG-Ⅰ表達的影響，我們采用小鼠部分肝臟IR模型(70％)，觀察IR后小鼠肝臟內(nèi)RIG-Ⅰ的表達。小鼠缺血60min后，取再灌注（血流開放）后不同時間點的肝臟組織，western-blot檢測IR后RIG-Ⅰ蛋白表達情況。結(jié)果顯示IR之后，肝組織RIG-Ⅰ的表達出現(xiàn)短時間的降低，隨著再灌注時間的延長，RIG-Ⅰ表達逐漸升高，免疫組化結(jié)果也證實IR后24h肝組織中炎癥細胞浸潤的細胞核周圍

9、可見RIG-Ⅰ蛋白DAB染色增多。
　　 隨后，我們進一步分析了RIG-Ⅰ表達變化主要發(fā)生在何種細胞。我們在IR后不同時間，采用兩步法分離出小鼠的肝細胞和非實質(zhì)細胞，分別對其RIG-Ⅰ的表達情況進行了分析。結(jié)果表明，肝臟IR后RIG-Ⅰ在肝細胞中有表達變化顯著，在非實質(zhì)細胞中無明顯變化，提示肝臟IR主要影響肝臟實質(zhì)細胞的RIG-Ⅰ表達。
　　 我們再進一步探討了肝臟IR影響RIG-Ⅰ表達的機制。由于RIG-Ⅰ上調(diào)的原因較

10、多，可以由IR后期產(chǎn)生的各種炎性細胞因子介導(dǎo)，我們主要關(guān)注在IR早期的RIG-Ⅰ下調(diào)現(xiàn)象。我們首先分析了IR過程中必然存在的氧化應(yīng)激在其中的作用，采用體外H2O2刺激新鮮分離的肝細胞、非實質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)H2O2呈劑量和時間依賴性下調(diào)肝細胞中RIG-Ⅰ表達，而對非實質(zhì)RIG-Ⅰ表達基本無作用，證實在肝臟IR后早期是氧化應(yīng)激作為誘因?qū)Ω闻K實質(zhì)細胞進行調(diào)控。根據(jù)RIG-Ⅰ蛋白表達下調(diào)的時間動力學(xué)特性，我們推測可能與現(xiàn)存蛋白的降解增加有關(guān)。因此，

11、我們采用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理新鮮分離出的肝細胞，之后再進行H2O2刺激，發(fā)現(xiàn)IR后RIG-Ⅰ的下調(diào)得到抑制，提示肝臟IR后RIG-Ⅰ下調(diào)的直接機制可能與泛素蛋白酶體通路活化所致的蛋白降解有關(guān)。
　　 二、 RIG-Ⅰ在肝臟IR損傷中的作用
　　 肝臟IR后RIG-Ⅰ表達的變化提示RIG-Ⅰ可能參與肝臟IR這一病理生理過程。在本部分實驗中，我們采用了RIG-Ⅰ缺陷的小鼠來探討RIG-Ⅰ信號通路在肝臟IR中的具體作

12、用。首先生化分析結(jié)果顯示RIG-Ⅰ缺陷小鼠在肝臟IR后肝功能指標（轉(zhuǎn)氨酶水平）升高幅度顯著低于同窩對照的野生型小鼠，提示RIG-Ⅰ缺陷能明顯減輕肝臟IR損傷。肝組織病理分析顯示，同窩對照的野生型小鼠在IR后24小時肝細胞大量凋亡，壞死區(qū)域明顯，而RIG-Ⅰ缺陷小鼠病理損傷程度明顯降低，suzuki's病理評分也進一步證實了這一結(jié)果。
　　 隨后，我們研究了RIG-Ⅰ缺陷之后的這種損傷減輕與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，采用免疫組化檢測巨噬細胞

13、(F4/80)的浸潤，結(jié)果顯示在RIG-Ⅰ缺陷小鼠巨噬細胞浸潤程度明顯降低，而進一步的結(jié)果表明其肝臟IR后炎癥因子的產(chǎn)生均較野生型小鼠顯著減低。凋亡與IR之間的關(guān)系密不可分，采用TUNEL法檢測肝組織凋亡，我們發(fā)現(xiàn)與同窩野生型小鼠組相比，RIG-Ⅰ缺陷也能明顯減輕肝細胞的凋亡，這就為RIG-Ⅰ缺陷小鼠病理損傷程度較輕進一步提供了證據(jù)。
　　 我們進一步通過構(gòu)建骨髓嵌合小鼠以確定實質(zhì)細胞還是非實質(zhì)細胞來源的RIG-Ⅰ在肝臟IR中發(fā)

14、揮作用，通過檢測嵌合小鼠IR后轉(zhuǎn)氨酶的水平發(fā)現(xiàn)實質(zhì)細胞缺陷RIG-Ⅰ和非實質(zhì)細胞缺陷RIG-Ⅰ小鼠的肝功能無明顯差異，但都低于野生型小鼠，說明實質(zhì)和非實質(zhì)細胞的RIG-Ⅰ都參與介導(dǎo)肝臟IR損傷，但由于肝臟實質(zhì)細胞占據(jù)肝臟細胞的絕大多數(shù)，且肝細胞的RIG-Ⅰ表達可以受IR調(diào)控，因此，在接下來的研究中，我們重點關(guān)注肝細胞的RIG-Ⅰ信號通路如何參與肝臟IR的進程。
　　 三、肝細胞RIG-Ⅰ信號通路通過促凋亡途徑而致肝臟IR損傷

15、r>　　 RIG-Ⅰ作為RLRs家族的重要成員，其所介導(dǎo)抗病毒反應(yīng)在機體抵抗病毒感染的天然免疫過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。RIG-Ⅰ信號通路的活化不僅能夠促進干擾素的產(chǎn)生，也能啟動干擾素產(chǎn)生非依賴的促凋亡信號。已有報道表明在人的黑色素瘤細胞中，RIG-Ⅰ信號的觸發(fā)可導(dǎo)致黑色素瘤細胞凋亡，但RIG-Ⅰ信號通路是否也參與介導(dǎo)肝臟IR后的凋亡，目前尚無相關(guān)的報道。鑒于凋亡是肝臟IR致?lián)p傷的關(guān)鍵機制之一，我們假設(shè)，RIG-Ⅰ信號通路增強肝臟I

16、R所致的損傷可能與通過促進肝臟IR誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。
　　 首先，我們采用western blot檢測了RIG-Ⅰ缺陷及野生小鼠在肝臟IR后早期caspase3、caspase8的活化情況，結(jié)果顯示，IR后RIG-Ⅰ缺陷小鼠肝組織中上述凋亡相關(guān)酶的活化顯著降低，提示RIG-Ⅰ信號通路與肝臟IR后的凋亡過程相關(guān)。我們進一步采用免疫共沉淀的方法證明了RIG-Ⅰ與caspase8二者存在直接的相互作用。
　　 為進一步研究在IR

17、過程中肝細胞的RIG-Ⅰ是如何得到活化，我們進行了以下實驗:將IR后的肝組織勻漿作為刺激物，分別對新鮮分離出的野生和RIG-Ⅰ缺陷的肝細胞刺激，通過RT-PCR檢測IFN-β的表達、western blot檢測IRF3的磷酸化水平，以及測定肝細胞凋亡情況等手段，檢測勻漿刺激對RIG-Ⅰ信號通路的活化情況。結(jié)果顯示:在野生肝細胞，IR后的肝組織勻漿可以促進IFN-β的產(chǎn)生，同時也介導(dǎo)凋亡，而在RIG-Ⅰ缺陷肝細胞，上述過程受到顯著的抑制。

18、由此我們認為IR后的肝組織勻漿具有激活RIG-Ⅰ信號通路的作用。
　　 我們在第二部分研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IR的肝組織勻漿中含有明顯升高的TNF-α、IL-6等細胞因子，這些細胞因子對RIG-Ⅰ信號通路可能存在一定的調(diào)節(jié)作用。此外，肝組織勻漿的制備過程中也必定會混入正常細胞的胞內(nèi)物質(zhì)，可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，我們借鑒文獻方法，制備了肝細胞以及非實質(zhì)細胞的壞死上清，作為條件培養(yǎng)基與新鮮分離的野生和RIG-Ⅰ-/-的肝細胞共孵育，并通

19、過流式檢測受刺激后肝細胞的凋亡情況。結(jié)果提示肝細胞和非實質(zhì)細胞中存在可以激活RIG-Ⅰ信號通路的物質(zhì)。為了進一步明確激活RIG-Ⅰ信號的配體，我們檢測了壞死上清內(nèi)的成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS含量在肝細胞和非實質(zhì)細胞的壞死上清中均較高，炎癥因子TNF-α和IL-1β的蛋白表達水平在壞死上清中無明顯改變，IL-6的蛋白水平在肝細胞壞死上清中輕度升高。隨后，我們采用H2O2作為ROS直接刺激新鮮分離的野生及RIG-Ⅰ-/-的肝細胞，并檢測刺激后IF

20、N-β的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ缺陷并未引起IFN-β的表達改變，提示ROS本身并不能激活RIG-Ⅰ信號通路。因此，我們推測可能是IR后受損的肝細胞或非實質(zhì)細胞所釋放的內(nèi)源性危險信號，包括RNA等物質(zhì)，激活肝細胞RIG-Ⅰ信號通路，進而通過促凋亡途徑而導(dǎo)致肝臟IR損傷。
　　 結(jié)合上述三部分的研究，我們得出結(jié)論，RIG-Ⅰ對肝臟IR后的損傷效應(yīng)呈正相促進作用。肝臟IR后早期因氧化應(yīng)激導(dǎo)致RIG-Ⅰ表達下調(diào)，其直接原因是泛素蛋