鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路在大鼠主動脈鈣化中的作用.pdf

1、目的：骨、牙齒之外的非骨性組織發(fā)生鈣化，伴或不伴組織壞死或損傷，均稱為異位鈣化。臨床上的異位鈣化涉及心臟瓣膜鈣化、血管鈣化、軟組織鈣化等，近年血管生物學的研究和心血管影像學（如電子光束計算機斷層掃描等）的進展，發(fā)現(xiàn)血管鈣化是動脈粥樣硬化、高血壓及糖尿病等多種疾病常見的、共同的病理變化，也是形成動脈斑塊引起管腔狹窄的重要因素之一。
　　 雖然血管鈣化是許多臨床疾病的重要特征，然而導致血管鈣化發(fā)病的確切機制尚不清楚。以往認為血管鈣化

2、是衰老時出現(xiàn)的異位骨化，是鈣鹽在細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)的被動沉積。然而新近的許多研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化并不是磷酸鈣結(jié)晶在血管壁的簡單而被動的沉積，而是一種類似于骨和軟骨形成的主動的調(diào)節(jié)過程，血管細胞（尤其是血管平滑肌細胞vascular smooth muscle cells，VSMCs）由正常的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌毎麡颖硇?，動脈粥樣硬化斑塊和鈣化損傷區(qū)含有多種骨基質(zhì)蛋白和成骨細胞標志物。
　　 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，

3、CaN）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，是唯一受Ca2+/鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶。CaN主要表達于細胞漿中，組織分布廣泛，通過使其最重要的底物活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFATs）去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，參與多種細胞的功能調(diào)節(jié)。研究證實CaN/NFATc信號通路在心肌細胞肥大和骨代謝中具有重要作用，還廣泛存在于免疫系統(tǒng)，調(diào)

4、節(jié)淋巴細胞生理性及病理性生長、分化和發(fā)育。CaN/NFATc信號通路不僅參與成骨細胞分化和成骨作用，還是破骨細胞分化所必需的，是否參與血管鈣化的調(diào)節(jié)過程，目前國內(nèi)外尚未見有報道。因此，設(shè)想通過此通路調(diào)節(jié)鈣化的血管，改善患者的臨床預(yù)后，為臨床治療展示了應(yīng)用前景。
　　 本試驗采用華法令和維生素D3建立大鼠血管鈣化模型，測定主動脈CaNAα、NFATc mRNA的表達、CaN和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，A

5、LP）活性，進行CaNB1和NFATc免疫組化染色，并觀察CaN特異性抑制劑環(huán)孢霉素A（cyclosporin A，CsA）對CaN/NFATc信號通路表達及血管鈣化的影響，初步探討CaN/NFATc信號通路在血管鈣化中的調(diào)節(jié)作用，為血管鈣化的臨床防治提供新的思路。
　　 方法：4w SD雄性大鼠36只，體重80～90g，隨機分為3組，每組12只。A組：對照組；B組：鈣化組；C組：CsA組；實驗第1-8天，各組均給予維生素K11

6、5mg·kg-1·d-1，皮下注射。同時，C組另給予CsA10m g·kg-1·d-1腹腔注射；A組和B組分別給予等量生理鹽水腹腔注射。第3天開始，B、C組另給予維生素D33×105U·kg-1·d-1，皮下注射，持續(xù)至實驗第5天，及華法令15mg·100g-1，12h一次，皮下注射，持續(xù)至第8天；對照組在相同時間給予等量生理鹽水皮下注射。實驗第9天，所有動物麻醉后處死。開胸，暴露出心臟，分離胸主動脈，并向下剖開腹部，分離出腹主動脈，從

7、主動脈根部至腹主動脈分叉處剪下主動脈。
　　 取材后每組各取6只用于進行CaNB1和NFATc免疫組化染色，原位雜交測定CaNAα和NFATc mRNA。6只用于組織CaN、ALP活性測定。將免疫組織化學和原位雜交結(jié)果應(yīng)用Image-Pro Plus圖象分析軟件，分別計算各組主動脈組織相同面積內(nèi)陽性細胞的累積光密度值（integrated optic density，IOD）。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（（）±s）表示，運用SPSS

8、13.0統(tǒng)計軟件，首先對計量資料進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗，P＜0.05即有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：（1）HE染色結(jié)果示對照組大鼠主動脈壁結(jié)構(gòu)完整，中層VSMCs排列整齊；鈣化組和CsA組大鼠主動脈中層VSMCs排列紊亂，彈力纖維迂曲斷裂。VonKossa染色示鈣化組大鼠主動脈中層彈性纖維間有大量黑色顆粒沉積；CsA組大鼠主動脈中層彈性纖維間亦可見黑色顆粒沉積；對照

9、組未見明顯黑色顆粒沉積。（2）免疫組織化學結(jié)果示對照組大鼠主動脈可見少量CaNB1、NFATc蛋白表達，主要位于胞漿內(nèi)：鈣化組大鼠主動脈CaNB1、NFATc蛋白較對照組表達明顯增加；CsA組大鼠主動脈CaNB1、NFATc蛋白較對照組達明顯增加，較鈣化組表達減少。（3）原位雜交結(jié)果顯示對照組大鼠主動脈可見CaNAα、NFATc mRNA表達，主要位于胞漿中；鈣化組大鼠主動脈CaNAα、NFATc mRNA較對照組表達明顯增加；CsA組

10、大鼠主動脈CaNAα、NFATc mRNA較對照組表達明顯增加，較鈣化組表達明顯減少。（4）鈣化組CaN活性較對照組明顯增加；CsA組CaN活性較對照組明顯增加；CsA組CaN活性與鈣化組比較無顯著性差異。（5）鈣化組ALP活性較對照組增加；CsA組ALP活性較對照組明顯增加，與鈣化組比較無顯著性差異。
　　 結(jié)論：1.本實驗采用華法令和維生素D3皮下注射成功地建立了大鼠主動脈鈣化模型，并且在透射電鏡下觀察了鈣化大鼠主動脈超微結(jié)