瘦素在缺氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)心肌中的重要作用.pdf

1、背景:在全球范圍內(nèi)，心血管疾病在人群中的發(fā)病率以及造成的死亡率都處于領(lǐng)先地位，而冠心病心肌梗死是心血管死亡的主要原因。大量的研究證明細(xì)胞移植療法能改善心肌梗死后心功能，近幾年已經(jīng)成為了心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多分化方向能力的成體干細(xì)胞，因其能夠在體外大量擴(kuò)增，進(jìn)行自體移植無(wú)排異及來(lái)源的限制，也不涉及倫理問(wèn)題，在細(xì)胞移植治療中具有獨(dú)到之處。大量研究顯示，間充質(zhì)干

2、細(xì)胞經(jīng)0.5％氧濃度缺氧預(yù)處理24h后，其移植治療心肌梗死的效果大大提高。然而目前仍然不清楚為何缺氧預(yù)處理能提高間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用。故此，我們?cè)诖颂接懥耸呛畏N機(jī)制引起了該種效應(yīng)。
　　方法:我們利用全骨髓貼壁的方法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，按照常氧與缺氧進(jìn)行預(yù)處理并比較兩者之間的差別(常氧:[21％ O2，5％ CO2]，缺氧:[0.5％O2，5％ CO2])。我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)、雙抗體夾心酶聯(lián)

3、免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)MSCs基因及蛋白水平瘦素(leptin)表達(dá)。在體外，我們利用共培養(yǎng)的方法觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用并利用TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。在體內(nèi)，我們同樣利用TUNEL染色法檢測(cè)移植細(xì)胞3天后梗死區(qū)與梗死周邊區(qū)心肌凋亡率。移植細(xì)胞28天后我們利用小動(dòng)物心超及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)小鼠心功能并利用Masson's染色法檢測(cè)梗死面積。
　　結(jié)果:目前的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞能通過(guò)旁分泌的作

4、用分泌多種細(xì)胞因子起到保護(hù)心肌的作用，leptin是其中重要的一員。大量研究證明leptin能直接抑制心肌細(xì)胞凋亡并且能促進(jìn)血管新生增強(qiáng)缺血心肌血供。
　　1.前期研究中我們通過(guò)基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，相較于正常培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞中，leptin基因表達(dá)上調(diào)。于是我們通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA檢測(cè)，證明缺氧間充質(zhì)干細(xì)胞leptin表達(dá)顯著提高。
　　2.在體外共培養(yǎng)試驗(yàn)中我們利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型，將

5、缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞在缺氧缺血清環(huán)境中共培養(yǎng)來(lái)觀察干細(xì)胞對(duì)于心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。首先我們應(yīng)用基因敲除技術(shù)干擾人間充質(zhì)干細(xì)胞中l(wèi)eptin基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)leptin基因敲除后其保護(hù)心肌細(xì)胞的作用大大降低。然后我們又利用leptin缺乏小鼠(ob/ob)間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)較正常小鼠(C57BL/6)干細(xì)胞，其保護(hù)心肌細(xì)胞的作用同樣大大降低。
　　3.我們利用結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制作小鼠心肌梗死模型，移植ob/o

6、b小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞與正常C57BL/6小鼠干細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。細(xì)胞移植后3天取小鼠心臟切片，利用TUNEL染色檢查心肌凋亡情況，我們發(fā)現(xiàn)相較于正常缺氧預(yù)處理C57BL/6小鼠移植組，缺氧預(yù)處理ob/ob干細(xì)胞移植組小鼠心肌凋亡率明顯提高。移植后28天經(jīng)小動(dòng)物心超與血流動(dòng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理ob/ob干細(xì)胞移植并不能起到保護(hù)小鼠心功能的作用。同樣的，masson's染色也表明leptin缺失后缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)梗死心肌減少心梗面積