缺氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植減輕糖尿病大鼠心肌凋亡并延緩心室重塑.pdf

1、糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病病人在不伴有冠狀動(dòng)脈疾病，心臟瓣膜病和高血壓病等的情況下出現(xiàn)的心功能不全，以早期的心肌舒張功能不全和晚期的收縮功能不全為特征。其病理表現(xiàn)為心肌微循環(huán)障礙，心肌細(xì)胞的凋亡和壞死及進(jìn)行性的間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致心肌灌注異常，晚期可出現(xiàn)充血性心力衰竭。因此維持心肌的微循環(huán)穩(wěn)態(tài)修復(fù)損傷心肌對(duì)于治療DCM有一定價(jià)值。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem

2、 cells，MSCs)是一種多能干細(xì)胞，在心肌微環(huán)境中可分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)它們可以釋放促進(jìn)血管生成和抗凋亡的因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatic growth factor,HGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF-1)等，從而激活內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制。在缺血性心臟病和擴(kuò)張性心

3、肌病的大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，MSCs移植能夠抑制心肌纖維化，降低基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix mctalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表達(dá)。然而MSCs移植后的低存活力大大限制了細(xì)胞治療的效果，而缺氧預(yù)處理(anoxie preconditioning,AP)可以增加MSCs的存活力和其治療心肌缺血損傷，減輕心肌凋亡和重塑的有效性。目前，對(duì)于MSCs在治療DCM中的價(jià)值尚未有相關(guān)報(bào)道。我們猜想MSCs可以保護(hù)糖尿病心肌

4、，而對(duì)MSCs進(jìn)行缺氧預(yù)處理可以增強(qiáng)這種保護(hù)作用。 研究方法： 7-8周的體重在160-180g的雄性SD大鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(60mg／kg)，24小時(shí)后血糖大于300mg/d1即認(rèn)為糖尿病建模成功。之后每周檢測(cè)血糖，血糖穩(wěn)定8周后大鼠DCM模型建立成功。骨髓MSCs由沖洗雄性的8周SD大鼠的股骨和脛骨骨髓腔并用密度梯度離心法分離獲取。3-5次傳代后貼壁的梭形骨髓MSCs得

5、到擴(kuò)增和純化。移植前采用流式細(xì)胞儀對(duì)骨髓MSCs進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用免疫熒光法檢測(cè)MSCs VEGF的表達(dá)情況。MSCs在體外用細(xì)胞膜染料CM-DiI(2μg／ml)標(biāo)記20分鐘。AP-MSCs缺氧(氧濃度<0.5％)3小時(shí)。糖尿病大鼠建模成功4個(gè)月后，糖尿病大鼠隨機(jī)分別心肌注射150μLDMEM(n=10)，5×106 MSCs／150μL，(n=10)，或5×106AP-MSCs／150μL(n=10)。每只大鼠按以下5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行心肌注

6、射：右室游離壁， 基底部和左室中前壁，側(cè)壁和后壁。在糖尿病大鼠建模成功后2月、3月及MSCs移植后2周，我們采用心臟超聲評(píng)價(jià)大鼠的心功能情況。并MSCs移植后2周，采用組織病理分析(毛細(xì)血管密度和纖維化面積)，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白、生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路蛋白的western blot分析及對(duì)MMP-2活性的明膠酶譜分析來評(píng)價(jià)DMEM、MSC和AP-MSC三組糖尿病大鼠的心臟情況。 結(jié)果： 1.糖尿病大鼠血糖升高，心功能下降

7、 糖尿病病程2月時(shí)，糖尿病大鼠的血糖明顯高于對(duì)照組大鼠(520±12 vs 113±5mg／dl，p<0.01)，而體重則明顯低于對(duì)照組(274±9 Vs 347±11g，p<0.01)。糖尿病大鼠的左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPW)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)明顯低于對(duì)照組(LVPW：1.6±0.1 VS 1.8±0.1mm

8、，p<0.05；FS：38.7±1.2 VS 46.2±1.2％，p<0.01)，左房?jī)?nèi)經(jīng)(left atrial dimension，LAD)在糖尿病組略高，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。糖尿病病程3月時(shí)，隨著糖尿病的進(jìn)展，糖尿病組大鼠的LVPW和FS進(jìn)一步下降(LVPW：1.1±O．1 VS1.85±0.1mm，p<0.01；FS：32.9±2.3 VS 44.5±2.0％，p<0.01)。由此可見，糖尿病病程2月時(shí)大鼠的心功能已明顯低于對(duì)照

9、組，而且隨著糖尿病進(jìn)展，糖尿病大鼠的心功能進(jìn)一步惡化。 2.MSCs的鑒定和移植后的體內(nèi)追蹤 體外培養(yǎng)的3.5代的MSCs多數(shù)表達(dá)CD44及CD90，而CD45的表達(dá)為陰性，提示這些細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源。MSCs也表達(dá)VEGF。移植后3天，在糖尿病大鼠心肌內(nèi)可見DiI標(biāo)記的MSCs，表明心肌注射成功，并有MSCs在糖尿病心肌內(nèi)定植。 3.MSCs特別是AP—MSCs改善了糖尿病大鼠的心功能 細(xì)胞移植

10、后2周，三組大鼠仍然為高血糖。AP-MSC組的心臟／體重指數(shù)偏低(p<0.01 vs DMEM組)，三組的室間隔厚度，左室舒張期內(nèi)徑和左室后壁厚度相當(dāng)，但與DMEM組相比AP-MSC組的左室收縮期內(nèi)經(jīng)較小(P<0.05)。DMEM、MSC和AP-MSC三組的FS分別為28.2±1.6％、34.9±1.4％和38.1±1.0％。MSCs移植，尤其是AP—MSC移植增加了糖尿病大鼠的FS (P<0.01，p<0.01)，改善了心功能。

11、 4、AP-MSCs增加了糖尿病大鼠心肌毛細(xì)血管密度，減輕了心肌纖維化 堿性磷酸酶染色顯示，AP-MSCs組毛細(xì)血管密度為2904±149／mm2，與DMEM組2210±86／mm2和MSC組2402+89／mm2相比，AP-MSC顯著增加了糖尿病大鼠心肌的毛細(xì)血管密度(P<0.01，P<0.01)。Masson染色顯示DMEM組較MSC組和AP-MSC組有著更為嚴(yán)重和廣泛的心肌纖維化。與DMEM組(8.2±0.2％)相比，M

12、SC組(7.4±0.2％)和AP．MSC組(6.7±0.2％)纖維化面積明顯下降(p<0.05，p<0.01)。此外，AP-MSC組和MSC組MMP-2活性也升高，分別是DMEM組的1.94±0.17倍(p<0.01)和1.31±0.07倍(無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。 5.AP-MSCs增加Bc1-2／Bax比值，減少caspase-3的激活 MSCs移植后2周，DMEM、MSC和AP-MSC三組心肌的Bel-2蛋白表達(dá)相當(dāng)，AP

13、-MSC組的Bax表達(dá)量偏低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而與DMEM組相比，AP-MSC組Bc1-2／Bax比值升高(P<0.05)。三組中caspase-3的表達(dá)相當(dāng)，而AP-MSC組被剪切的具有活性的caSpause-3表達(dá)低于DMEM和MSC組(p<0.01，p<0.01)。 6、AP-MSCs降低了糖尿病心肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B-1表達(dá) 移植后2周，三組的心肌VEGF蛋白表達(dá)未見明顯差異。而AP-MSC組心肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(

14、transforming growth factor,TGF)B-1表達(dá)低于DMEM和MSC組(p<0.01,p<0.01)。 7、AP-MSCs誘導(dǎo)了糖尿病心肌AKT和ERK的磷酸化 Western blot顯示，移植后2周三組大鼠心肌總的Akt和ERK表達(dá)量相當(dāng)，但糖尿病大鼠心肌的磷酸化Akt和磷酸化ERK水平在AP-MSC移植后明顯上調(diào)，MSC組的磷酸化ERK水平也略有上調(diào)。 結(jié)論： AP-MSCs

15、上調(diào)了大鼠糖尿病心肌Bc1-2／Bax比例并抑制caspase-3的表達(dá)和激活，從而減輕了心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而改善了心肌的微循環(huán)。同時(shí)AP-MSCs增加了糖尿病心肌MMP-2活性并抑制了TGFB-1的表達(dá)，減輕了糖尿病心肌的纖維化。 心肌內(nèi)注射MSCs對(duì)糖尿病心肌病具有保護(hù)作用，對(duì)MSCs進(jìn)行缺氧預(yù)處理可以增強(qiáng)這種保護(hù)作用。AP-MSCs可能是通過激活A(yù)KT和ERK通路來發(fā)揮抗凋亡及減輕心室重塑作用從而改善了糖尿病大鼠的心功