骨髓間充質干細胞保護大鼠移植小腸黏膜屏障的研究.pdf

1、目的:1.成功建立穩(wěn)定的大鼠異位小腸移植急性排斥反應模型。
　　2.探討小腸移植急性排斥反應對腸黏膜屏障中緊密連接的超微結構、蛋白及mRNA水平的影響。
　　3.探討骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM MSCs)減輕大鼠急性排斥反應、保護腸黏膜屏障緊密連接的作用。
　　方法:1.本實驗使用采用異位輔助小腸移植，顯微鏡下吻合血管，腹壁雙口造瘺建立急性排斥反應模型，

2、分為兩組:無排斥反應組(Lewis-Lewis，n=33)和排斥反應組(BN-Lewis，n=43)。術后記錄手術時間，以及缺血時間，比較兩組生存率。詳細記錄每天的活動狀態(tài)，以及體重變化。并于術后1、3、5、7、10d切取移植小腸，觀察其形態(tài)及活力的變化，行病理組織切片HE染色，了解排斥反應的發(fā)生及等級。
　　2.本實驗分為三組:空白對照組(Lewis，n=30)，無排斥反應組(Lewis-Lewis，n=33)和排斥反應組(BN

3、-Lewis，n=43)。ELISA檢測血漿二胺氧化酶及D-乳酸了解腸黏膜屏障功能損傷情況，透射電鏡觀察腸道的緊密連接的超微結構改變，應用Western Blot、RT-PCR檢測緊密連接蛋白Occludin和ZO-1蛋白和mRNA表達水平的變化，檢測血漿炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ和白介素-10，了解其變化與緊密連接超微結構改變、緊密連接蛋白和mRNA表達水平的變化的相關性，以及其機制。
　　3.本實驗分為三組:無排

4、斥反應組(Lewis-Lewis，n=33)，排斥反應組（BN-Lewis，經陰莖背靜脈輸注1 mL生理鹽水，n=43）和干細胞治療組（BN-Lewis，經陰莖背靜脈輸注1 mL含5×106BM MSCs的培養(yǎng)液，n=33）。術后觀察大鼠活動狀態(tài)的恢復，檢測腸黏膜屏障功能、緊密連接的超微結構以及緊密連接蛋白Occludin和ZO-1蛋白、mRNA表達水平的變化，以此評價BMMSCs的保護作用，并且檢測術后血漿中TNF-α、IFN-γ、T

5、GF-β和IL-10水平隨時間是否變化，以及各組之間的變化差異，探討B(tài)M MSCs保護腸黏膜屏障的可能機制。
　　結果:1.無排斥反應組與排斥反應組術后10d的生存率分別為90.91％，69.77％，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。排斥反應組于術后3d開始出現(xiàn)排斥反應表現(xiàn)，至7d達重度排斥反應，期間體重下降，平均每日下降5.23 g;無排斥反應組則未出現(xiàn)特異的排斥反應表現(xiàn)，術后體重平均每日減低6.11 g，至6d開始情況好轉，平均每

6、日增加體重6 g。移植小腸病理HE染色證實:排斥反應組3d開始出現(xiàn)輕度排斥反應，5d表現(xiàn)中度排斥反應，至7d以后發(fā)展為重度排斥反應。
　　2.小腸移植排斥反應損傷腸黏膜屏障較無排斥反應組有顯著差異，[二胺氧化酶(U/mL):35.84±5.6 vs12.75±0.4,3 d;46.50±0.8 vs16.27±0.6,5 d;54.01±1.7vs19.40±0.8，7d，bP＜0.05; D-乳酸（g/L）:8.01±0.78

7、vs6.20±0.15，3 d;9.11±0.45vs8.23±0.26，5 d;12.60±1.0 vs10.37±0.6，7d，bP＜0.05]，透射電鏡下緊密連接斷裂，細胞器損傷，蛋白印跡發(fā)現(xiàn)Occludin、ZO-1蛋白表達減少。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Occludin、ZO-1蛋白的mRNA表達與蛋白改變一致，隨排斥反應嚴重而減少。并且ELISA檢測細胞因子發(fā)現(xiàn)TNF-α和IFN-γ升高，IL-10顯著降低，與無排斥反應組比較有統(tǒng)

8、計學差異(P＜0.05);
　　3.采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法提取、分離、培養(yǎng)受體Lewis大鼠BMMSCs，采用流式細胞表型鑒定干細胞純度達95％以上。BM MSCs輸注后，排斥反應病理評分減低（排斥反應組vs干細胞治療組:69.5±2.43 vs41.83±2.93，bP＜0.05，5d），腸黏膜屏障通透性降低[二胺氧化酶(U/mL):46.50±0.77 vs39.15±3.98,5d,bP＜0.05;D-乳酸(g/L)

9、:9.11±0.45 vs7.031±0.18,5d,bP＜0.05],修復緊密連接超微結構及受損的細胞器。增加緊密連接蛋白Occludin、ZO-1蛋白與mRNA表達，同時發(fā)現(xiàn)炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ水平顯著減少，而TGF-β和IL-10明顯增加，且與排斥反應組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　結論:1.成功建立穩(wěn)定的大鼠異位小腸移植急性排斥反應模型。
　　2.小腸移植排斥反應損傷腸黏膜屏障功能及結構，影響