人腦膠質(zhì)瘤及其腫瘤干細(xì)胞Livin基因與化療耐藥關(guān)系研究.pdf

1、第一部分、Livin基因表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 目的：探討Livin基因表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征及其與細(xì)胞凋亡、增殖的關(guān)系。 方法：41例人腦膠質(zhì)瘤組織，分為高度惡性組（Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí)）23例和低度惡性組（Ⅰ級(jí)～Ⅱ級(jí)）18例，以10例正常腦組織做對(duì)照，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Livin蛋白和Ki67的表達(dá)，并分析記錄其標(biāo)記指數(shù)(LI)和增殖指數(shù)(Ki67-PI)，應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)

2、移酶介導(dǎo)的X-dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并分析記錄其凋亡指數(shù)(AI)。 結(jié)果： ①41例膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ivin表達(dá)率為87.8％，10例正常腦組織中無(wú)Livin蛋白表達(dá)(P< 0.01)。Livin表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)明顯相關(guān)(P< 0.05)，與膠質(zhì)瘤病理類(lèi)型,是否復(fù)發(fā)無(wú)明顯相關(guān)（P>0.05）。 ②41例膠質(zhì)瘤中Ki67陽(yáng)性率為56.1％（23/41），10例正常腦組織中無(wú)Ki67表達(dá)

3、(P< 0.01)。Ki67表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)明顯相關(guān)(P<0.05)。 ③41例膠質(zhì)瘤和10例正常腦組織行凋亡檢測(cè)均有凋亡細(xì)胞檢出，膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡較正常腦組織增加，平均AI分別為1.89（0.81～2.92）,0.37(0.15～0.67),二者有顯著性差異（P<0.01）。細(xì)胞凋亡隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)升高而增加(P<0.05)。 ④Livin-LI與Ki67-PI、AI都隨著膠質(zhì)瘤的惡性程度升高而增加，相關(guān)分析顯示，

4、Livin-LI與Ki67-PI、Livin-LI與AI、Ki67-PI與AI均呈正相關(guān)（rs=1.000，P<0.01）。 結(jié)論：Livin基因通過(guò)在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞增殖，使得細(xì)胞增殖占優(yōu)勢(shì)，造成腫瘤惡性表現(xiàn)，這可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Livin在膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)，而在正常腦組織中不表達(dá)，其有望成為一種有效、敏感的瘤標(biāo)，并為膠質(zhì)瘤的基因治療提供新靶點(diǎn)。Livin在膠質(zhì)

5、瘤復(fù)發(fā)中所扮演的角色還有待于今后進(jìn)一步研究。 第二部分、人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定及其Livin與多重耐藥基因的表達(dá)。 目的：從人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、TJ905、GL15中分離、培養(yǎng)和鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并探討二者的生物學(xué)特性及其抗凋亡和耐藥基因的表達(dá)差異。 方法：人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、TJ905、GL15經(jīng)過(guò)處理后，經(jīng)免疫磁珠分離獲取CD133+細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)方法獲得

6、腫瘤干細(xì)胞球，用含有10％的胎牛血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，分化前后分別做Nestin、tubulin -β、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色，WST-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，并觀(guān)察腫瘤干細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。同時(shí)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)livin，livinα，Livinβ，survivin，MRP1和MRP3的表達(dá)。 結(jié)果： 人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、TJ905、GL15中含有CD133+細(xì)胞，這些細(xì)胞具有典型的

7、干細(xì)胞特性，Nestin染色為陽(yáng)性；在無(wú)血清培養(yǎng)基中呈懸浮球樣生長(zhǎng)，能夠自我更新和增殖，在有血清培養(yǎng)基中能夠分化，tubulin -β、GFAP染色為陽(yáng)性，說(shuō)明這些細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。U251、GL15細(xì)胞與兩例膠質(zhì)瘤組織及其培養(yǎng)成功的腫瘤干細(xì)胞分別檢測(cè)livin、livinα、livinβ和MRP-1、MRP-3mRNA表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞比較其同源的膠質(zhì)瘤組織或細(xì)胞livin、livinα、livinβ、Surv

8、ivin和MRP-1表達(dá)量明顯增加；TJ905腫瘤干細(xì)胞livin、livinα、livinβ、Survivin、MRP-1、MRP-3表達(dá)量較TJ905單層培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)量都有不同程度的降低。 結(jié)論：從人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、TJ905、GL15中成功分離培養(yǎng)了腫瘤干細(xì)胞，并能在體外進(jìn)行增殖和分化，這為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性提供實(shí)驗(yàn)載體。TJ905干細(xì)胞球抗凋亡和MRP基因表達(dá)量較TJ905單層培養(yǎng)細(xì)胞

9、表達(dá)量都有不同程度的降低，這與本文研究U251、GL15細(xì)胞與兩例膠質(zhì)瘤組織及其培養(yǎng)成功的與其同源的腫瘤干細(xì)胞結(jié)果不一致。這個(gè)現(xiàn)象是有啟發(fā)意義的，說(shuō)明干細(xì)胞分化和去分化過(guò)程中有很多的不確定因素影響整個(gè)進(jìn)程。這似乎也提示腫瘤干細(xì)胞在腫瘤耐藥機(jī)制中發(fā)揮的作用不盡相同，也不總是造成腫瘤耐藥的唯一因素，這需要在今后的研究中進(jìn)一步探明。 第三部分、化療藥物對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞Livin基因表達(dá)的影響。 目的：探討化療藥物

10、對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞livin、MRP基因表達(dá)的影響，并分析livin基因表達(dá)與化療耐藥的關(guān)系。 方法：利用人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251及其分離成功的腫瘤干細(xì)胞，分別用不同濃度的化療藥物（尼莫司汀Nimustine、紫杉醇Taxol、依托泊甙Etoposide、卡鉑Carboplatin）進(jìn)行干預(yù)48h后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量的RT-PCR技術(shù)檢測(cè)livin、survivin、MRP基因的表達(dá)量，采用WST-8法測(cè)定細(xì)胞增殖和細(xì)

11、胞毒性，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期變化，倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，共聚焦顯微鏡觀(guān)察凋亡和死亡細(xì)胞。 結(jié)果：藥物干預(yù)后的U251細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，見(jiàn)散在細(xì)胞碎片，隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞（球）量明顯減少；腫瘤干細(xì)胞比較其同源的U251細(xì)胞表現(xiàn)了更強(qiáng)的耐藥性，同一濃度藥物干預(yù)后的細(xì)胞存活率腫瘤干細(xì)胞比較其同源的U251細(xì)胞差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同一濃度藥物干預(yù)后的腫瘤干細(xì)胞比較其同源

12、的U251細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞減少，活細(xì)胞增加，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同一藥物濃度干預(yù)的腫瘤干細(xì)胞比較其同源的U251細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞livin、livinβ和MRP-1、MRP-3 mRNA表達(dá)量增加，而livinα、Survivin mRNA表達(dá)量降低，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：藥物干預(yù)后的U251細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞增殖受到明顯抑制，腫瘤干細(xì)胞與其同源的U251細(xì)胞比較livin