eNOS基因轉染抑制血管損傷后平滑肌細胞增生的實驗研究.pdf

1、基因治療是將一個有治療作用的基因片段,通過各種載體介導,轉移至作用部位,使其在局部發(fā)揮作用,從而避免了對全身產生副作用.該實驗通過構建含有目的基因eNOS cDNA的真核表達載體pcDNA3.1-內皮型一氧化氮合酶(pcDNA3.1-eNOS),轉染血管損傷后大鼠頸總動脈血管平滑肌細胞,觀察其對損傷后血管平滑肌細胞增生的抑制作用.第一部分真核表達載體pcDNA3.1-內皮型一氧化氮(pcDNA3.1-eNOS)的構建方法:利用限制性內切

2、酶EcoR Ⅰ將原核載體pUC13-eNOS酶切并提取其中的eNOS cDNA,與真核載體pcDNA3.1(-)通過EcoR Ⅰ相連接,構建成pcDNA3.1-eNOS真核表達載體,并經限制性內切酶酶切及PCR技術鑒定重組載體是否含有目的基因eNOS cDNA.第二部分大鼠頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型的建立及血管平滑肌細胞的體外培養(yǎng)方法:(1)制備Wastar大鼠左側頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型,經組織病理切片進行HE和Verhoeff

3、鐵蘇木精染色觀察血管再狹窄程度;(2)進行血管平滑肌細胞的體外培養(yǎng),應用抗平滑肌細胞的α-actin抗體鑒定平滑肌細胞.第三部分eNOS基因轉染對大鼠球囊損傷后血管平滑肌細胞增殖規(guī)律的影響及對血管再狹窄程度的影響方法:(1)以Fugene 6作為載體將pcDNA3.1-eNOS基因轉染至體外培養(yǎng)的Wastar大鼠頸總動脈球囊損傷后的血管平滑肌細胞,應用RT-PCR、原位雜交及免疫熒光染色方法檢測細胞內pcDNA3.1-eNOS基因和eN