阿糖胞苷對cFLIPL mRNA在急性白血病原代細胞表達的影響.pdf

1、背景和目的:細胞凋亡與壞死是完全不同的死亡方式。前者是一種由基因控制的自主性、程序性死亡,其對保持組織的健康和正常生長有十分重要的意義。細胞凋亡過程受抑,可使細胞生存期延長,將利于轉化突變的細胞生長積聚,最終致使腫瘤的產生。細胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達以及酶類和信號傳導途徑的調控。目前發(fā)現(xiàn)機體內存在兩類影響細胞凋亡的基因,即促凋亡基因如Reaper、Smac/DIABLO、Bax、HtrA2和抗凋亡基因如Bcl-2、P53、XIA

2、P、CrmA及cFLIP(細胞型Fas相關死亡區(qū)域蛋白樣白介素Ⅰ轉換酶抑制蛋白,cFLIP)。cFLIP是新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡抑制蛋白,包括長型和短型兩種亞型,即cFLIPL和cFLIPS。該蛋白在結構上與caspase-8類似,但不具備caspase-8的蛋白水解酶活性。它與含死亡結構域的Fas相關蛋白(FADD)結合后,可競爭性地阻斷capsase-8與FADD的結合,使得capsase-8不能被活化,caspase-8介導的蛋白酶級聯(lián)

3、反應不能進行,從而阻斷了Fas介導的細胞內凋亡信號轉導通路中的關鍵環(huán)節(jié),使腫瘤細胞免于凋亡。急性白血病是一種惡性血液病,大約占癌癥總發(fā)病率的5％。近年來,其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢,但其發(fā)病機制仍不十分清楚。因此,急性白血病的病因學和發(fā)病機制仍是目前研究的熱點。本文應用逆轉錄酶/聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測cFLIPL mRNA的表達水平,探討在cFLIPL mRNA急性白血病原代細胞表達及阿糖胞苷(Ara-C)對cFLIPL m

4、RNA在急性白血病細胞表達的影響,從而為揭示白血病的發(fā)病機理提供一定的幫助。
　　材料與方法:1.病例資料:26例患者的骨髓樣本均取自鄭州大學第一附屬醫(yī)院血液科2008年4月~2008年12月住院患者。平均年齡:40歲(16歲-63歲),其中男16例,女10例。經過血常規(guī)、骨髓細胞形態(tài)學、細胞化學、免疫表型及細胞遺傳學確診,符合急性白血病的診斷標準(張之南主編的《血液病診斷及療效標準(第三版)》)。10例非惡性血液病患者作為對照組

5、,平均年齡38歲(21歲-57歲),其中男4例,女6例。2.細胞培養(yǎng)取26例初診的急性白血病患者肝素抗凝骨髓5ml,密度梯度離心分離單個核細胞,洗滌2次后分2組在培養(yǎng)瓶中進行體外培養(yǎng):未處理組、Ara-C處理組(Ara-C濃度為120μg/ml),同時取非惡性血液病患者(10例)作為對照組,密度梯度離心分離骨髓單個核細胞,洗滌2次后調整細胞濃度為1×107/ml。在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時。3.RT-PCR方法

6、收獲培養(yǎng)的細胞,沈滌后用TRIZOL法提取RNA,逆轉錄試劑盒合成cDNA,化學合成針對cFLIPL mRNA的探針,并以β-actin做內對照,在擴增儀中進行25個循環(huán)的PCR反應。將PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳,紫外線觀察并測定相關條帶的光密度值后,計算擴增的cFLIPL mRNA與β-actinmRNA的灰度比值,以cFLIPL mRNA/β-action mRNA的比值表示目的基因cFLIPLmRNA的相對表達水平。4.應用S

7、PSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,對計數資料采用X2檢驗,統(tǒng)計學數據用均數±標準差(X±s)表示。兩樣本均數的比較采用配對資料的t檢驗,多樣本均數的比較采用方差分析。以α=0.05作為檢驗水準。
　　結果:1.在初治的急性白血病患者26例中,20例患者骨髓單個核細胞表達cFLIPLmRNA,陽性率為76.9％(20/26)。在對照組中僅一例表達,表達率為10.0％(1/10)。cFLIPL mRNA在初治的AL中的陽性表達率高于

8、正常對照組(X2=4.511,P=0.034)。在20例表達cFLIPL mRNA的患者中,其表達量為0.47±0.140,對照組1例陽性者表達量為0.19。2.cFLIPL在不同系列急性白血病的表達:在19例急性髓系白血病(AML)患者中15例患者骨髓單個核細胞表達cFLIPL mRNA,其陽性表達率為81.3％;在7例急性淋巴細胞白血病(ALL)患者中5例患者骨髓單個核細胞表達cFLIPLmRNA,其陽性表達率71.4％,但兩組間差

9、別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在15例表達cFLIPL mRNA的AML患者中,其表達量為0.49±0.152,在5例表達cFLIPLmRNA的ALL患者中,其表達量為0.45±0.127(X2=0.022,P=0.883);兩組cFLIPLmRNA表達量均高于對照組(X2=19.81,P=0.00)。3.阿糖胞苷對cFLIPL mRNA在急性白血病表達的影響:用120μg/ml Ara-C作用急性白血病患者骨髓單個核細胞24h后,顯

10、著下調cFLIPL mRNA的表達水平;與未加藥組相比,加藥組cFLIPL mRNA表達水平明顯下調,差異具有顯著性(P<0.01);Ara-C處理組cFLIPL mRNA在急性白血病中的表達水平仍較正常對照組高,但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4.急性白血病骨髓單個核細胞cFLIPL mRNA表達水平與臨床療效的關系:本組26例急性白血病患者接受標準化療方案治療1療程后評估療效,其中20例cFLIPL mRNA高表達者CR率為

11、60.00％,6例不表達者CR率為83.33％。兩組間差別有顯著性意義(X2=7.231,P=0.026)。
　　結論:1.急性白血病細胞中cFLIPL mRNA的表達水平顯著高于非惡性血液病骨髓細胞的表達水平。2.急性髓系白血病與急性淋巴細胞白血病細胞中cFLIPL mRNA的表達水平無顯著性差異。3.Ara-C能夠下調急性白血病細胞中cFLIPL mRNA的表達水平。4.cFLIPL表達高者,其臨床緩解率低,提示cFLIPL可