阿糖胞苷對cFLIPL mRNA在急性白血病原代細(xì)胞表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:細(xì)胞凋亡與壞死是完全不同的死亡方式。前者是一種由基因控制的自主性、程序性死亡,其對保持組織的健康和正常生長有十分重要的意義。細(xì)胞凋亡過程受抑,可使細(xì)胞生存期延長,將利于轉(zhuǎn)化突變的細(xì)胞生長積聚,最終致使腫瘤的產(chǎn)生。細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及酶類和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)存在兩類影響細(xì)胞凋亡的基因,即促凋亡基因如Reaper、Smac/DIABLO、Bax、HtrA2和抗凋亡基因如Bcl-2、P53、XIA

2、P、CrmA及cFLIP(細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣白介素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白,cFLIP)。cFLIP是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白,包括長型和短型兩種亞型,即cFLIPL和cFLIPS。該蛋白在結(jié)構(gòu)上與caspase-8類似,但不具備caspase-8的蛋白水解酶活性。它與含死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白(FADD)結(jié)合后,可競爭性地阻斷capsase-8與FADD的結(jié)合,使得capsase-8不能被活化,caspase-8介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)

3、反應(yīng)不能進(jìn)行,從而阻斷了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),使腫瘤細(xì)胞免于凋亡。急性白血病是一種惡性血液病,大約占癌癥總發(fā)病率的5％。近年來,其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢,但其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。因此,急性白血病的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制仍是目前研究的熱點(diǎn)。本文應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測cFLIPL mRNA的表達(dá)水平,探討在cFLIPL mRNA急性白血病原代細(xì)胞表達(dá)及阿糖胞苷(Ara-C)對cFLIPL m

4、RNA在急性白血病細(xì)胞表達(dá)的影響,從而為揭示白血病的發(fā)病機(jī)理提供一定的幫助。
　　材料與方法:1.病例資料:26例患者的骨髓樣本均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科2008年4月~2008年12月住院患者。平均年齡:40歲(16歲-63歲),其中男16例,女10例。經(jīng)過血常規(guī)、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫表型及細(xì)胞遺傳學(xué)確診,符合急性白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(第三版)》)。10例非惡性血液病患者作為對照組

5、,平均年齡38歲(21歲-57歲),其中男4例,女6例。2.細(xì)胞培養(yǎng)取26例初診的急性白血病患者肝素抗凝骨髓5ml,密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞,洗滌2次后分2組在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行體外培養(yǎng):未處理組、Ara-C處理組(Ara-C濃度為120μg/ml),同時(shí)取非惡性血液病患者(10例)作為對照組,密度梯度離心分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,洗滌2次后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。3.RT-PCR方法

6、收獲培養(yǎng)的細(xì)胞,沈滌后用TRIZOL法提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,化學(xué)合成針對cFLIPL mRNA的探針,并以β-actin做內(nèi)對照,在擴(kuò)增儀中進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳,紫外線觀察并測定相關(guān)條帶的光密度值后,計(jì)算擴(kuò)增的cFLIPL mRNA與β-actinmRNA的灰度比值,以cFLIPL mRNA/β-action mRNA的比值表示目的基因cFLIPLmRNA的相對表達(dá)水平。4.應(yīng)用S

7、PSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用配對資料的t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)的比較采用方差分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.在初治的急性白血病患者26例中,20例患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)cFLIPLmRNA,陽性率為76.9％(20/26)。在對照組中僅一例表達(dá),表達(dá)率為10.0％(1/10)。cFLIPL mRNA在初治的AL中的陽性表達(dá)率高于

8、正常對照組(X2=4.511,P=0.034)。在20例表達(dá)cFLIPL mRNA的患者中,其表達(dá)量為0.47±0.140,對照組1例陽性者表達(dá)量為0.19。2.cFLIPL在不同系列急性白血病的表達(dá):在19例急性髓系白血病(AML)患者中15例患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)cFLIPL mRNA,其陽性表達(dá)率為81.3％;在7例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者中5例患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)cFLIPLmRNA,其陽性表達(dá)率71.4％,但兩組間差

9、別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在15例表達(dá)cFLIPL mRNA的AML患者中,其表達(dá)量為0.49±0.152,在5例表達(dá)cFLIPLmRNA的ALL患者中,其表達(dá)量為0.45±0.127(X2=0.022,P=0.883);兩組cFLIPLmRNA表達(dá)量均高于對照組(X2=19.81,P=0.00)。3.阿糖胞苷對cFLIPL mRNA在急性白血病表達(dá)的影響:用120μg/ml Ara-C作用急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞24h后,顯

10、著下調(diào)cFLIPL mRNA的表達(dá)水平;與未加藥組相比,加藥組cFLIPL mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào),差異具有顯著性(P<0.01);Ara-C處理組cFLIPL mRNA在急性白血病中的表達(dá)水平仍較正常對照組高,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4.急性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞cFLIPL mRNA表達(dá)水平與臨床療效的關(guān)系:本組26例急性白血病患者接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療1療程后評估療效,其中20例cFLIPL mRNA高表達(dá)者CR率為

11、60.00％,6例不表達(dá)者CR率為83.33％。兩組間差別有顯著性意義(X2=7.231,P=0.026)。
　　結(jié)論:1.急性白血病細(xì)胞中cFLIPL mRNA的表達(dá)水平顯著高于非惡性血液病骨髓細(xì)胞的表達(dá)水平。2.急性髓系白血病與急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中cFLIPL mRNA的表達(dá)水平無顯著性差異。3.Ara-C能夠下調(diào)急性白血病細(xì)胞中cFLIPL mRNA的表達(dá)水平。4.cFLIPL表達(dá)高者,其臨床緩解率低,提示cFLIPL可