清毒片及hTERT mRNA反義核酸對(duì)急性白血病影響的研究.pdf

1、本課題通過(guò)文獻(xiàn)、臨床及實(shí)驗(yàn)三個(gè)環(huán)節(jié)探討了清毒片及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERTmRNA)反義核酸對(duì)急性白血病的影響，以期獲得治療急性白血病的新途徑。 1文獻(xiàn)研究 1.1目的：為本課題研究提供理論依據(jù)。 1.2方法：通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，分析總結(jié)了端粒酶、hTERT、反義核酸與急性白血病關(guān)系及中醫(yī)藥治療急性白血病作用機(jī)理。 1.3結(jié)果： 1.3.1端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)；hTERT

2、是調(diào)節(jié)端粒酶活性高低的限速?zèng)Q定因子；急性白血病及其細(xì)胞株存在端粒酶活性和hTERTmRNA的高表達(dá)情況。抑制端粒酶活性可作為抗白血病的新途徑。 1.3.2反義核酸可與目的基因的特定序列相結(jié)合，抑制、封閉或破壞靶基因，干擾遺傳信息從核酸向蛋白質(zhì)的傳遞。以hTERTmRNA為靶點(diǎn)的反義核酸可抑制端粒酶活性。 1.3.3中醫(yī)藥在誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)分化、逆轉(zhuǎn)耐藥、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)及調(diào)控基因表達(dá)等方面發(fā)揮抗急性白血病的作用。 1.

3、4結(jié)論：中藥和反義核酸均能調(diào)控基因表達(dá)，故理論上中藥同hTERTmRNA反義核酸聯(lián)合應(yīng)用有可能得到抗白血病的協(xié)同效應(yīng)。 2臨床研究 2.1第一節(jié)：急性白血病患者中醫(yī)證型與hTERTmRNA表達(dá)關(guān)系的研究 2.1.1目的：探討急性白血病患者h(yuǎn)TERTmRNA表達(dá)的中醫(yī)本質(zhì)，為尋找合理的中藥干預(yù)hTERTmRNA表達(dá)提供理論依據(jù)。 2.1.2方法：采用半定量RT-PCR法檢測(cè)了29例不同證型急性白血病患者外周

4、血單個(gè)核細(xì)胞hTERTmRNA表達(dá)的異同，以20例正常人作對(duì)照。 2.1.3結(jié)果：急性白血病患者h(yuǎn)TERTmRNA表達(dá)量明顯高于與正常人，兩組間差異有顯著性意義(P＜0.01)。急性白血病患者中以毒熱熾盛型hTERTmRNA表達(dá)量最高，各中醫(yī)證型hTERTmRNA表達(dá)量由小到大依次為瘀血痰結(jié)型＜?xì)怅巸商撔停级緹釤胧⑿?。毒熱熾盛型和瘀血痰結(jié)型比較，有顯著性差異(P＜0.05)。毒熱熾盛型與氣陰兩虛型比較，P=0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、。氣陰兩虛型與瘀血痰結(jié)型比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.1.4結(jié)論：與虛、瘀、痰等因素相比，毒可能與hTERT最具有相關(guān)性，即hTERTmRNA的高表達(dá)反映中醫(yī)“毒”的本質(zhì)。解毒之法可能可作為干預(yù)hTERTmRNA表達(dá)，從而治療急性白血病的方法。 2.2第二節(jié)：清毒片對(duì)急性白血病患者h(yuǎn)TERTmRNA表達(dá)影響的研究 2.2.1目的：觀察以解毒法為主的經(jīng)驗(yàn)藥物清毒片對(duì)急性白血病患者h(yuǎn)TERTmRNA表達(dá)的

6、影響，以證實(shí)臨床研究第一節(jié)中“解毒之法可能可以干預(yù)hTERTmRNA表達(dá)”的推測(cè)，并從中西醫(yī)兩個(gè)方面探討清毒片治療急性白血病的作用機(jī)制，且為分析后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)論分析提供依據(jù)。 2.2.2方法：將20例毒熱熾盛型和瘀血痰結(jié)型急性白血病患者隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組各10例。對(duì)照組按常規(guī)化療方案誘導(dǎo)緩解治療，觀察組在常規(guī)化療方案誘導(dǎo)緩解治療同時(shí)加服清毒片，觀察期限為8周。所有患者均于化療前及第8周末檢測(cè)外周血象、骨髓象變化及外周

7、血單個(gè)核細(xì)胞hTERTmRNA的表達(dá)。 2.2.3結(jié)果：經(jīng)清毒片聯(lián)合化療治療的患者h(yuǎn)TERTmRNA表達(dá)明顯下降。清毒片聯(lián)合化療在改善外周血象、骨髓象方面優(yōu)于單純化療，其中對(duì)貧血的改善作用最為明顯(P＜0.05)。在完全緩解率方面，兩組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，可能與樣本數(shù)偏少有關(guān)。清毒片聯(lián)合化療在下調(diào)hTERTmRNA表達(dá)方面明顯優(yōu)于單純化療(P＜0.05)。 2.2.4結(jié)論：以解毒法為主清毒片聯(lián)合化療治療急

8、性白血病優(yōu)于單純化療，下調(diào)hTERTmRNA的表達(dá)可能是清毒片治療急性白血病的作用機(jī)制之一。清熱解毒、祛邪安正的功效是清毒片的中醫(yī)作用機(jī)制。 3實(shí)驗(yàn)研究 3.1目的：通過(guò)臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)清毒片下調(diào)hTERTmRNA表達(dá)可能是其治療急性白血病的作用機(jī)制之一。在實(shí)驗(yàn)部分中，我們擬觀察清毒片、hTERT反義核酸、清毒片聯(lián)合hTERT反義核酸對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株(HL-60)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞hTERTmRNA表達(dá)

9、的影響，分析產(chǎn)生影響的作用機(jī)制；觀察均能影響hTERTmRNA表達(dá)的清毒片與反義核酸聯(lián)用是否產(chǎn)生協(xié)同作用，探討清毒片聯(lián)合反義核酸治療急性白血病的可行性，為今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3.2方法：通過(guò)血清藥理學(xué)方法制備清毒片小鼠含藥血清；常規(guī)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞；制備hTERT反義核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物；分別將清毒片小鼠含藥血清(清毒片組)、hTERT反義核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物(反義核酸組)、清毒片小鼠含藥血清聯(lián)合hTERT反義核酸-脂質(zhì)

10、體復(fù)合物(清毒片加反義核酸組)作用于HL-60細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)HL-60細(xì)胞增殖抑制率，采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法早期凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞hTERTmRNA的表達(dá)；以蒸餾水小鼠血清作用于HL-60細(xì)胞作陰性對(duì)照組，對(duì)阿糖胞苷作用于HL-60細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照組，以HL-60細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)體系作空白對(duì)照組。 3.3結(jié)果： 3.3.1清毒片及hTERT反義

11、核酸對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制的影響 蒸餾水組細(xì)胞增殖抑制率與空白對(duì)照組接近，兩組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；清毒片組對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率較反義核酸組略低，但兩組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；清毒片聯(lián)合反義核酸對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用明顯高于單獨(dú)使用清毒片或反義核酸，特別是在第72小時(shí)，其組間抑制率比較有顯著性差異(P＜0.05)；對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率從高到低依次為：阿糖胞苷組＞清毒片加反義核酸組＞反

12、義核酸組＞清毒片組＞蒸餾水組；實(shí)驗(yàn)各組還表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴(lài)性，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率升高。 3.3.2清毒片及hTERT反義核酸對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響 3.3.2.1細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)藥物處理后細(xì)胞，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體縮小，胞膜完整，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，核染色質(zhì)凝集，核固縮等符合凋亡細(xì)胞的改變，而蒸餾水組和常規(guī)培養(yǎng)體系的細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化。 3.3.2.2AnnexinV-FITC/

13、PI雙標(biāo)記法細(xì)胞早期凋亡流式檢測(cè) 蒸餾水組與空白對(duì)照組三個(gè)時(shí)間段凋亡率相比較，其差異均無(wú)顯著性意義(P＞0.05)；阿糖胞苷組與空白對(duì)照組及其余各組三個(gè)時(shí)間段的凋亡率相比較，其差異均有極顯著性意義(P＜0.01)；清毒片加反義核酸組與反義核酸組及清毒片組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡率從高到低依次為：阿糖胞苷組＞清毒片加反義核酸組＞反義核酸組＞清毒片組＞蒸餾水組；實(shí)驗(yàn)各組表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴(lài)性，即隨

14、著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HL-60細(xì)胞凋亡率升高；加藥各組凋亡率與空白對(duì)照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；空白對(duì)照組表現(xiàn)較低的凋亡率。 3.3.3清毒片及hTERT反義核酸對(duì)HL-60細(xì)胞hTERTmRNA表達(dá)的影響 蒸餾水組與空白對(duì)照組相比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；加藥各組與空白對(duì)照組、蒸餾水組比較，組間差異有極顯著性意義(P＜0.01)；反義核酸組、清毒片加反義核酸組與阿糖胞苷組、清毒片組比較，組間差異有

15、極顯著性意義(P＜0.01)；清毒片加反義核酸組與阿糖胞苷組、清毒片組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；清毒片加反義核酸組與反義核酸組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。下調(diào)程度從高到低依次為：清毒片加反義核酸組＞反義核酸組＞清毒片組＞阿糖胞苷組。 3.4結(jié)論：在對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及下調(diào)hTERTmRNA表達(dá)方面，清毒片與反義核酸聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)，且表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴(lài)性。與阿糖胞苷相比，清毒片聯(lián)合反義