錳對海馬依賴學習記憶的損傷及牛磺酸的干預研究.pdf

1、盡管是機體必需的微量元素，錳更多的是因其急性高濃度或長期低劑量的暴露導致不可逆的神經系統(tǒng)毒性而受到關注。生產工藝的改進及勞保措施的完善使得高濃度的職業(yè)錳暴露漸漸不再占據主導地位，而隨著交通工具的平民化，含錳抗爆汽油消耗劇增直接導致汽油燃燒后排放到大氣中各種含錳煙塵增加，農業(yè)上含錳農藥的推廣，醫(yī)療上含錳化合物的廣范使用…普通人群的環(huán)境錳暴露范圍在擴大，累積暴露劑量在增長。流行病學調查認為錳暴露累積劑量的增加與帕金森氏癥的發(fā)病率正相關。暴露

2、方式與劑量的變化直接影響了發(fā)生的結果，錳誘導出現嚴重的錐體外系癥狀已似乎不再，更多的是早期神經精神癥狀，如頭疼、嗜睡、神經衰弱、認知能力降低、食欲減退等非特異性且易被忽視的綜合癥。因此，建立錳暴露動物模型探討神經精神癥狀有助闡明其早期神經毒機理。具有廣泛生物學功能的條件必須氨基酸—?；撬崾遣溉閯游锷窠浵到y(tǒng)中含量僅次于谷氨酸的游離氨基酸，大量的研究認為，?；撬崮艽龠M神經細胞的增殖、分化及延緩神經細胞衰老，影響中樞神經系統(tǒng)神經遞質分泌及某些

3、肽類物質含量，調節(jié)細胞鈣穩(wěn)態(tài)，保護神經細胞免受多種化學物質損傷等作用而發(fā)揮健腦益智功能，現今已在臨床用于早老性癡呆、各種急慢性腦病的預防與治療。本課題組前期的研究也觀察到?；撬岣纳坡匀惧i誘導的大鼠學習記憶障礙，該作用可能與?；撬岜Ｗo海馬神經細胞免受錳誘導細胞凋亡有關，但?；撬釋τ诒┞对缙诔霈F的神經精神癥狀的干預效果及其機理尚有待完善。因此，本研究將建立急性、亞慢性染錳動物模型，通過Morris水迷宮觀察大鼠的學習記憶變化，測定紅細胞錳

4、濃度，海馬組織膽堿乙酰轉移酶、乙酰膽堿酯酶的活力以指示乙酰膽堿的代謝變化，進一步采用免疫組織化學方法觀察發(fā)出膽堿能神經纖維到海馬的基底前腦膽堿能神經元的形態(tài)、數量變化，最后采用蛋白質組學技術尋找海馬在不同狀態(tài)下的差異表達蛋白質，并對部分鑒定的差異蛋白作蛋白、基因表達水平的進一步驗證，同時對?；撬犷A防及治療的效果進行觀察。
　　方法：
　　一、?；撬釋﹀i誘導大鼠空間學習記憶損傷的干預研究
　　急性染毒:100只SPF雄性

5、SD大鼠隨機分5組，分別為:生理鹽水(NS)對照組(C)，連續(xù)ip0.9％NS，實驗期限為4w;染錳Ⅰ組(M1)，每日ip MnCl2.4H2O(15mg/kg.d)，連續(xù)4w;?；撬犷A防組(P)，染錳的同時ip?；撬?200mg/kg.d)，持續(xù)4w;?；撬嶂委熃M(T)，染錳4w結束后再ip?；撬?00mg/kg.d，治療4w，即ip MnC12.4H2O28d+ip?；撬?8d，時長8w;染錳Ⅱ組(M2)，染錳4w結束后再ip NS

6、4w，即ipMnCl2.4H2O28d+ip NS28d，實驗期共8w。
　　亞慢性染毒:各組染毒劑量及頻率不變，時長則延長一倍，即染毒總時長C、M1、P為8w，T及M2則為16w(8w+8w)。
　　上述兩亞組大鼠分別在最后一次干預結束后24h進行水迷宮實驗，分別以頭5天平均逃避潛伏時間及第六天的平臺搜索次數評估大鼠空間學習能力及空間記憶能力的變化。
　　二、?；撬釋θ惧i大鼠紅細胞錳、鐵含量的干預研究
　　兩亞

7、組動物完成水迷宮后頸椎脫臼處死，迅速開胸采心臟血，抗凝劑抗凝后離心去除白細胞及血漿蛋白，分離紅細胞，消化后電感耦合等離子發(fā)光儀測定各組紅細胞的錳負荷及鐵含量，反映紅細胞錳含量作為錳暴露早期觀察指標的穩(wěn)定性及與之密切相關的鐵含量的變化。
　　三、牛磺酸對染錳大鼠海馬乙酰膽堿代謝變化的干預研究
　　分離各組動物的海馬組織，制備組織勻漿液，測定乙酰膽堿合成、分解的兩個關鍵酶—膽堿乙酰轉移酶及乙酰膽堿酯酶活力以指示海馬組織中乙酰膽堿

8、代謝的變化，探討?；撬釋毙?、亞慢性染錳改變此兩酶活力與學習記憶能力影響之間的關系。
　　四、?；撬釋θ惧i大鼠基底前腦膽堿能神經細胞的干預研究
　　各染毒組動物灌注固定后切片行免疫組化染色，觀察基底前腦膽堿乙酰轉移酶陽性神經細胞形態(tài)及數量變化，探討染錳及?；撬岣深A對基底前腦乙酰膽堿能細胞影響及其與學習記憶的關系。
　　五、?；撬釋θ惧i大鼠海馬毒性干預作用的蛋白質組學研究
　　各染毒動物分離海馬組織，制備總蛋白進行

9、二維電泳分離蛋白，經軟件比對選擇差異表達的蛋白質點進行鑒定，探討?；撬岣深A對染錳誘導海馬神經毒性的特異靶蛋白。
　　六、牛磺酸干預對急性染錳大鼠海馬部分差異蛋白質的表達研究
　　采用蛋白免疫印跡及相對熒光定量PCR選擇感興趣的差異蛋白進一步進行蛋白及分子表達水平的驗證。
　　結果：
　　一、?；撬釋﹀i誘導大鼠空間學習記憶損傷的干預研究
　　1、?；撬釋毙匀惧i誘導大鼠空間學習記憶損傷的干預研究
　　水

10、迷宮實驗結果表明:染錳Ⅰ組大鼠平均逃避潛伏時間(39.8±2.3)s較對照組(29.5±2.5)s及?；撬犷A防組(29.4±2.3)s顯著延長（P＜0.05），染錳Ⅱ組(56.6±3.0)s與?；撬嶂委熃M(27.8±2.3)s相比顯著延長(P＜0.05)，平臺搜索次數染錳Ⅰ組(3.2±3.2)較對照組(4.5±3.5)有降低趨勢，?；撬犷A防(5.7±3.1)顯示出上調染錳所致平臺搜索次數減少的趨勢，與染錳Ⅱ組(6.1±2.0)相比，牛磺

11、酸治療組(4.8±3.3)的平臺搜索次數反而減少，但各組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　2、?；撬釋喡匀惧i誘導大鼠空間學習記憶損傷的干預研究
　　水迷宮實驗結果反映平均逃避潛伏時間染錳Ⅰ組(53.6±4.3)較對照組(38.5±4.3)及?；撬犷A防組(38.6±4.3)顯著延長（P＜0.05），?；撬嶂委熃M(39.1±3.5)與較染錳Ⅱ組(56.0±3.8)顯著縮短（P＜0.05），平臺搜索次數染錳Ⅰ組(2.0±2.1)較對照

12、組(7.5±4.3)及?；撬犷A防組(6.5±3.6)顯著降低（P＜0.05），?；撬嶂委熃M(2.5±2.6)與染錳Ⅱ組(5.4±3.1)相比無顯著差異。
　　二、?；撬釋θ惧i大鼠紅細胞錳、鐵含量的干預研究
　　4w染錳Ⅰ組大鼠紅細胞錳含量(0.158±0.017) mg/L較對照組(0.090±0.006)mg/L顯著增高，?；撬犷A防(0.154±0.023)mg/L并未顯示出有降低紅細胞錳含量的效果，其錳負荷依然顯著高于對

13、照組，?；撬嶂委熃M(0.099±0.016)mg/L與染錳Ⅱ組(0.094±0.011)mg/L相比紅細胞錳含量無差異。8w染錳Ⅰ組大鼠紅細胞錳(0.134±0.015) mg/L依然高于對照組，牛磺酸預防(0.127±0.021) mg/L也未改變紅細胞錳負荷狀態(tài)，仍然顯著高于對照組。與染錳Ⅱ組(0.087±0.006)mg/L相比，牛磺酸治療組(0.078±0.006)mg/L紅細胞錳含量顯著降低。然而，紅細胞鐵含量在急性、亞慢性染

14、毒及?；撬岣深A各組中并未觀察到改變。
　　三、?；撬釋θ惧i大鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化的干預研究
　　1、?；撬釋毙匀惧i大鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化的干預研究
　　染錳Ⅰ組海馬組織乙酰膽堿酯酶活力(0.63±0.16)(U/mgprot)與空白對照組(0.65±0.11)(U/mgprot)相比無顯著差異，但預防組酶活力(0.23±0.06)(U/mgprot)較之對照組及染錳Ⅰ組則顯著下降（P＜0.05），染錳Ⅱ組

15、(0.21±0.07)(U/mgprot)較治療組(0.44±0.12)(U/mgprot)顯著降低(P＜0.05);與對照組比較(24.2±2.5)(IU/g)，染錳Ⅰ組(18.0±9.9)(IU/g)、牛磺酸預防組(18.9±4.5)的海馬組織乙酰膽堿轉移酶活力稍有降低但并不明顯（P＞0.05），?；撬嶂委熃M(31.2±10.3)(IU/g)該酶活力則較染錳Ⅱ組(21.16±8.6)(IU/g)顯著上調（P＜0.05）。
　　

16、2、?；撬釋喡匀惧i大鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化的干預研究
　　染錳Ⅰ組海馬組織乙酰膽堿酯酶活力(0.40±0.26)(U/mgprot)與空白對照組(0.29±0.10)(U/mgprot)相比有上升趨勢但無統(tǒng)計學差異，牛磺酸預防(0.20±0.04)(U/mgprot)明顯下調海馬組織中乙酰膽堿酯酶活力(P＜0.05)，治療組(0.25±0.06)乙酰膽堿酯酶活性較(U/mgprot)染錳Ⅱ組(0.34±0.03)(U/mg

17、prot)顯著降低。染錳Ⅰ組海馬組織乙酰膽堿轉移酶活力(13.24±5.09)(IU/g)較對照組(30.27±9.47)(IU/g)顯著降低,?；撬犷A防(20.88±9.50)(IU/g)有上調錳抑制的乙酰膽堿移酶活力趨勢，但并無顯著效果。牛磺酸治療(31.77±4.60)(IU/g)能顯著增加乙酰膽堿轉移酶活力（P＜0.05）。
　　四、牛磺酸對染錳大鼠基底前腦膽堿能神經細胞的干預研究
　　1?；撬釋毙匀惧i大鼠基底前腦

18、(vDB/HDB)膽堿能神經細胞的干預研究
　　與對照組vDB/hDB(167.17±14.08/150.00±9.86)相比，染錳Ⅰ組vDB/hDB(97.00±11.87/83.67±3.61)ChAT陽性細胞數量顯著減少(p＜0.05)，?；撬犷A防vDB/hDB(168.50±17.89/115.67±8.98)顯著增加染錳誘導減少的ChAT陽性細胞(p＜0.05)，vDB數量甚至可及正常對照組，hDB盡管也顯著高于染錳Ⅰ組

19、，但仍顯著低于對照組(p＜0.05);與染錳Ⅱ組vDB/hDB(144.5±12.29/120.33±8.16)相比，牛磺酸治療顯著增加vDB(163.17±10.50)ChAT陽性細胞(p＜0.05)，但hDB(116.17±16.13)無顯著差異(p＞0.05)。
　　2、牛磺酸對亞慢性染錳大鼠基底前腦(vDB/hDB)膽堿能神經細胞的干預研究
　　與對照組vDB/hDB(245.0±57.37/184.50±32.09

20、)相比，染錳Ⅰ組vDB/hDB(188.00±26.63/115.17±20.88) ChAT陽性細胞數量顯著減少(p＜0.05)，?；撬犷A防vDB/hDB(167.40±39.81/189.80±48.71)僅能顯著增加hDB染錳誘導減少的ChAT陽性細胞(p＜0.05)，而vDB甚至無顯性低于染錳組，并顯著低于對照組(p＜0.05）;?；撬嶂委熃MvDB/hDB(156.40±14.19/195.60±35.54)ChAT陽性細胞在v

21、DB顯著低于染錳Ⅱ組的相應區(qū)域(265.67±49.64)(p＜0.05)，但hDB(116.17±16.13)則與染錳Ⅱ組相應區(qū)(165.33±33.24)無顯著差異(p＞0.05)。
　　五、?；撬釋θ惧i大鼠海馬毒性干預作用的蛋白質組學研究
　　1、?；撬釋毙匀惧i大鼠海馬毒性干預作用的蛋白質組學研究
　　各組凝膠蛋白經發(fā)現，對照組觀察到(1108+89)個蛋白點，染錳Ⅰ組觀察到(1005士140)個蛋白點，牛磺酸

22、預防組觀察到(1218±204)個蛋白點，染錳Ⅱ組觀察到（1130±151）個蛋白點，牛磺酸治療組觀察到(1099±163)個蛋白點，對照組—染錳Ⅰ組(C-M)匹配后發(fā)現46個差異點，染錳Ⅰ組—?；撬犷A防組(M1-P)匹配后發(fā)現46個差異點，染錳Ⅱ組—?；撬嶂委熃M(M2-T)匹配后發(fā)現29個差異點，各差異點表達變化量≥2倍以上。選擇上述差異點進行鑒定，經肽指紋圖譜(PFT)及串聯質譜鑒定了35(35/46)、13(13/29)、17(1

23、7/21)各蛋白質。C-M1組的35個差異蛋白中涉及能量代謝、細胞骨架蛋白、核酸代謝、蛋白代謝、信號轉導、囊泡轉運、氧化調節(jié)、胞吞作用及新發(fā)現的蛋白，M1-p組的13個差異蛋白包含能量代謝、細胞骨架、細胞骨架調節(jié)蛋白、中間蛋白、分子伴侶、氧化調節(jié)蛋白等，M2-T組的17個差異蛋白涉及能量代謝、細胞骨架、細胞骨架調節(jié)、蛋白調節(jié)與代謝、脂質代謝、分子伴侶、囊泡運輸、胞吞調節(jié)、神經發(fā)育與分化及新發(fā)現的蛋白等。
　　2、牛磺酸對亞慢性染錳

24、大鼠海馬毒性干預作用的蛋白質組學研究
　　各組凝膠經圖像分析發(fā)現，對照組觀察到(997±110)個蛋白點，染錳Ⅰ組觀察到(1008±94)個蛋白點，?；撬犷A防組觀察到(1107±185)個蛋白點，染錳Ⅱ組觀察到(1201±147)個蛋白點，?；撬嶂委熃M觀察到(1312±179)個蛋白點，對照組—染錳Ⅰ組(C-M1)匹配后發(fā)現12個差異點，染錳Ⅰ組—?；撬犷A防組(M1-P)匹配后發(fā)現8個差異點，染錳Ⅱ組—?；撬嶂委熃M(M2-T)匹配

25、后發(fā)現17個差異點，各差異點表達變化量≥2倍以上。選擇上述差異點進行鑒定，經肽指紋圖譜(PFT)及串聯質譜鑒定了8(8/12)、2(2/8)、4(4/17)個蛋白質，C-M1的8個蛋白涉及酶、細胞骨架、氧化還原調節(jié)、鈣調家族、胞吐作用調節(jié)、激素刺激調節(jié)等，M1-P組兩個已鑒定蛋白分別是prepro-A-type allatostatin及膠原纖維酸性蛋白，M2-T組4個蛋白涉及細胞骨架、細胞粘附及蛋白去折疊。
　　六、?；撬岣深A對

26、急性染錳大鼠海馬部分差異蛋白質的表達研究
　　染錳Ⅰ組及牛磺酸預防組HSP7的表達量較對照組小幅升高，但無差異;治療組與染錳Ⅱ組間亦無差異。染錳Ⅰ組Prx3較對照組降低，?；撬犷A防或治療組Prx3的表達量稍低于相同染毒時長的染錳組，但各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對照組、染錳Ⅰ組及?；撬犷A防組間HSP7 mRNA表達無顯著差異(P＞0.05)，而治療組HSP7mRNA顯著高于染錳Ⅱ組;染錳后Prx3mRNA表達降低，牛磺

27、酸預防或治療對該基因表達與同時長染錳組相比無差異(P＞0.05);染錳Ⅰ組NDUFS1mRNA表達較對照組低，牛磺酸預防提高該基因表達，但差異不顯著(P＞0.05)，治療組mRNA表達顯著高于染錳Ⅱ組(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、?；撬犷A防或治療可改善急性、亞慢性染錳誘導的學習記憶障礙。
　　2、?；撬峥赏ㄟ^調節(jié)膽堿能系統(tǒng)而影響急性、亞慢性染錳誘導的學習記憶障礙。
　　3、蛋白質組學實驗揭示急性、亞慢性