siRNA沉默TGF-β1對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的影響.pdf

1、第一部分，目的：構(gòu)建載體表達(dá)shRNA以沉默TGF-β1的表達(dá)，觀察其減少系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接蛋白(Fn)和Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)的作用，探討用shRNA防治腎臟纖維化的新途徑。 方法：針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的核苷酸序列構(gòu)建表達(dá)shRNA的載體、轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細(xì)胞，通過RT-PCR動(dòng)態(tài)觀察系膜細(xì)胞TGF-β1和Fn的mRNA的變化、通過ELISA動(dòng)態(tài)觀察TGF-β1、Fn和Col-Ⅳ

2、蛋白的變化，同時(shí)用WesternBlot進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1、Fn的改變。 結(jié)果：通過對(duì)構(gòu)建的3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的2條序列之一或二已被分別成功地插入了相應(yīng)的質(zhì)粒pEGFP6載體中；將已構(gòu)建好的3個(gè)載體分別轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)2條干擾序列中，只有針對(duì)TGF-β1mRNA 538-556的干擾序列，具有顯著的干擾效應(yīng)，表現(xiàn)為沉默TGF-β1mRNA

3、效應(yīng)持續(xù)48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(細(xì)胞上清)持續(xù)48hrs、沉默細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白持續(xù)到72hrs。相應(yīng)地，TGF-β1的有效沉默有效地延緩了脂質(zhì)體刺激所導(dǎo)致的Fn分泌峰值的出現(xiàn)，而系膜細(xì)胞總Col-Ⅳ蛋白的表達(dá)在24hrs、48hrs也顯著性下調(diào)。 結(jié)論：針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRNA 538-556序列構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體pEGFP6，能夠有效沉默系膜細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，伴Fn和C

4、ol-Ⅳ蛋白表達(dá)的顯著下調(diào)，可能具有顯著的抗纖維化效應(yīng)。 第二部分，目的：為了沉默系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)，構(gòu)建針對(duì)SD大鼠TGF-β1基因的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體pEGFP6 vector，以便于用該載體轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細(xì)胞，在系膜細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shRNA發(fā)揮沉默效應(yīng)。 方法：針對(duì)SD大鼠的TGF-β1 mRNA的538-556和895-913核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)

5、2段各含有19nt的干擾序列。在體外按照5′→3′方向人工合成依序?yàn)楦蓴_序列正義鏈(或反義鏈)、Loop環(huán)和反義鏈(或正義鏈)及相應(yīng)部位的多克隆酶切位點(diǎn)和終止信號(hào)，得到小發(fā)夾cDNA正義鏈(或反義鏈)長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)，然后將合成的小發(fā)夾cDNA正、反義鏈混合、高溫融解、退火得到小發(fā)夾cDNA(small hairpin cDNA)雙鏈，再用T4 DNA連接酶將其插入pEGFP6-1或pGEGP6-4 VectorU6的BamHⅠ和EcoR Ⅰ之

6、間，重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選kana抗性克隆，提取質(zhì)粒，分別對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體進(jìn)行酶切、測(cè)序，確認(rèn)得到兩種能夠表達(dá)一條干擾序列的質(zhì)粒，然后再繼續(xù)將這兩個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ+PstⅠ雙酶切，分別回收含有兩個(gè)干擾序列的大、小片段，用T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、篩選kana抗性克隆、提取質(zhì)粒，再行酶切和DNA測(cè)序鑒定。 結(jié)果：酶切和DNA測(cè)序證實(shí)，針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRNA的兩個(gè)序列己分別(表達(dá)單條)或同時(shí)

7、(表達(dá)2條)正確地插入了pEGFP6質(zhì)粒中。 結(jié)論：分別得到了能夠表達(dá)單條shRNA的質(zhì)粒2個(gè)或同時(shí)表達(dá)2條shRNAs的質(zhì)粒1個(gè)。 第三部分，目的：用構(gòu)建好的能夠表達(dá)TGF-β1 shRNA的pEGFP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察其沉默系膜細(xì)胞TGF-β1的效應(yīng)情況。 方法：通過使用脂質(zhì)體Lipfectamine<'TM>2000將表達(dá)TGF-β1 shRNA的pEGFP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細(xì)胞，然后

8、分別在24hrs、48hrs、72hrs時(shí)間段內(nèi)觀察系膜細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的變化：分別用RT-PCR和ELISA測(cè)定觀察系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA半定量和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白的動(dòng)態(tài)變化，用western Blot測(cè)定72hrs時(shí)間段內(nèi)系膜細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的表達(dá)。最后通過SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，找出干擾效應(yīng)最好的干擾序列和時(shí)間段。 結(jié)果：針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRNA位點(diǎn)538-556的shRN

9、A，能夠顯著性地沉默系膜細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，其中沉默TGF-β1的mRNA效應(yīng)持續(xù)48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(細(xì)胞上清ELISA)持續(xù)48hrs、沉默細(xì)胞內(nèi)的TGF-β1蛋白持續(xù)到72hrs；而針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRNA位點(diǎn)895-913的shRNA沒有顯示出明顯的特異性干擾效應(yīng)；能夠同時(shí)表達(dá)上述2條干擾序列的質(zhì)粒載體，顯示出了二者干擾效應(yīng)的疊加傾向。 結(jié)論：針對(duì)SD大鼠TGF-β1 mRN

10、A位點(diǎn)538-556的特異性shRNA能夠在mRNA和蛋白水平上顯著性沉默SD大鼠TGF-β1基因的表達(dá)；表達(dá)2條干擾序列的質(zhì)粒載體，顯示出干擾效應(yīng)疊加的傾向。 第四部分，目的：在shRNA有效沉默TGF-β1情況下，觀察系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)和四型膠原(type Ⅳ collage，Col-Ⅳ)的動(dòng)態(tài)變化。 方法：在表達(dá)TGF-β1 shRNA的pEGFP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細(xì)胞后，

11、觀察系膜細(xì)胞表達(dá)Fn和Col-Ⅳ的變化及其與TGF-β1沉默效應(yīng)的關(guān)系，對(duì)于24hrs、48hrs和72brs系膜細(xì)胞的Fn mRNA表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的Fn和Col-Ⅳ蛋白濃度，分別采用RT-PCR和ELISA方法動(dòng)態(tài)觀察。 結(jié)果：在脂質(zhì)體Lipfectamine<'TM>2000刺激下，除了TGF-β1被有效沉默的2組外，各組系膜細(xì)胞分泌Fn顯著增加，并于24hrs達(dá)到峰值濃度，而TGF-β1被有效沉默的2組的Fn升高沒有

12、前者明顯(P<0.01)，其峰值濃度被推遲到48hrs才出現(xiàn)；各組的Fn mRNART-PCR半定量也呈現(xiàn)出類似的變化。各組系膜細(xì)胞蛋白提取液中ELISA測(cè)定Col-Ⅳ蛋白提示，TGF-β1被有效沉默的2組均出現(xiàn)了Col-Ⅳ的顯著下降，以24hrs、48hrs為明顯，72hrs仍有低于對(duì)照組的傾向，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：shRNA沉默TGF-β1的表達(dá)，能夠顯著下訓(xùn)Col-Ⅳ的表達(dá)，延緩Fn峰值的出現(xiàn)。脂質(zhì)體Lipfectam