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文檔簡介
1、第一部分,目的:構(gòu)建載體表達shRNA以沉默TGF-β1的表達,觀察其減少系膜細胞表達纖維連接蛋白(Fn)和Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)的作用,探討用shRNA防治腎臟纖維化的新途徑。 方法:針對SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的核苷酸序列構(gòu)建表達shRNA的載體、轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細胞,通過RT-PCR動態(tài)觀察系膜細胞TGF-β1和Fn的mRNA的變化、通過ELISA動態(tài)觀察TGF-β1、Fn和Col-Ⅳ
2、蛋白的變化,同時用WesternBlot進一步證實TGF-β1、Fn的改變。 結(jié)果:通過對構(gòu)建的3個質(zhì)粒進行DNA測序發(fā)現(xiàn),針對SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的2條序列之一或二已被分別成功地插入了相應(yīng)的質(zhì)粒pEGFP6載體中;將已構(gòu)建好的3個載體分別轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細胞后,發(fā)現(xiàn)2條干擾序列中,只有針對TGF-β1mRNA 538-556的干擾序列,具有顯著的干擾效應(yīng),表現(xiàn)為沉默TGF-β1mRNA
3、效應(yīng)持續(xù)48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(細胞上清)持續(xù)48hrs、沉默細胞內(nèi)TGF-β1蛋白持續(xù)到72hrs。相應(yīng)地,TGF-β1的有效沉默有效地延緩了脂質(zhì)體刺激所導(dǎo)致的Fn分泌峰值的出現(xiàn),而系膜細胞總Col-Ⅳ蛋白的表達在24hrs、48hrs也顯著性下調(diào)。 結(jié)論:針對SD大鼠TGF-β1 mRNA 538-556序列構(gòu)建的shRNA表達載體pEGFP6,能夠有效沉默系膜細胞TGF-β1的表達,伴Fn和C
4、ol-Ⅳ蛋白表達的顯著下調(diào),可能具有顯著的抗纖維化效應(yīng)。 第二部分,目的:為了沉默系膜細胞TGF-β1 mRNA的表達,構(gòu)建針對SD大鼠TGF-β1基因的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)表達載體pEGFP6 vector,以便于用該載體轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細胞,在系膜細胞內(nèi)表達shRNA發(fā)揮沉默效應(yīng)。 方法:針對SD大鼠的TGF-β1 mRNA的538-556和895-913核苷酸序列,分別設(shè)計
5、2段各含有19nt的干擾序列。在體外按照5′→3′方向人工合成依序為干擾序列正義鏈(或反義鏈)、Loop環(huán)和反義鏈(或正義鏈)及相應(yīng)部位的多克隆酶切位點和終止信號,得到小發(fā)夾cDNA正義鏈(或反義鏈)長鏈結(jié)構(gòu),然后將合成的小發(fā)夾cDNA正、反義鏈混合、高溫融解、退火得到小發(fā)夾cDNA(small hairpin cDNA)雙鏈,再用T4 DNA連接酶將其插入pEGFP6-1或pGEGP6-4 VectorU6的BamHⅠ和EcoR Ⅰ之
6、間,重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選kana抗性克隆,提取質(zhì)粒,分別對構(gòu)建的表達載體進行酶切、測序,確認得到兩種能夠表達一條干擾序列的質(zhì)粒,然后再繼續(xù)將這兩個質(zhì)粒進行SalⅠ+PstⅠ雙酶切,分別回收含有兩個干擾序列的大、小片段,用T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、篩選kana抗性克隆、提取質(zhì)粒,再行酶切和DNA測序鑒定。 結(jié)果:酶切和DNA測序證實,針對SD大鼠TGF-β1 mRNA的兩個序列己分別(表達單條)或同時
7、(表達2條)正確地插入了pEGFP6質(zhì)粒中。 結(jié)論:分別得到了能夠表達單條shRNA的質(zhì)粒2個或同時表達2條shRNAs的質(zhì)粒1個。 第三部分,目的:用構(gòu)建好的能夠表達TGF-β1 shRNA的pEGFP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細胞,動態(tài)觀察其沉默系膜細胞TGF-β1的效應(yīng)情況。 方法:通過使用脂質(zhì)體Lipfectamine<'TM>2000將表達TGF-β1 shRNA的pEGFP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細胞,然后
8、分別在24hrs、48hrs、72hrs時間段內(nèi)觀察系膜細胞表達TGF-β1的變化:分別用RT-PCR和ELISA測定觀察系膜細胞TGF-β1mRNA半定量和細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白的動態(tài)變化,用western Blot測定72hrs時間段內(nèi)系膜細胞內(nèi)TGF-β1的表達。最后通過SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件做統(tǒng)計學(xué)處理,找出干擾效應(yīng)最好的干擾序列和時間段。 結(jié)果:針對SD大鼠TGF-β1 mRNA位點538-556的shRN
9、A,能夠顯著性地沉默系膜細胞TGF-β1的表達,其中沉默TGF-β1的mRNA效應(yīng)持續(xù)48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(細胞上清ELISA)持續(xù)48hrs、沉默細胞內(nèi)的TGF-β1蛋白持續(xù)到72hrs;而針對SD大鼠TGF-β1 mRNA位點895-913的shRNA沒有顯示出明顯的特異性干擾效應(yīng);能夠同時表達上述2條干擾序列的質(zhì)粒載體,顯示出了二者干擾效應(yīng)的疊加傾向。 結(jié)論:針對SD大鼠TGF-β1 mRN
10、A位點538-556的特異性shRNA能夠在mRNA和蛋白水平上顯著性沉默SD大鼠TGF-β1基因的表達;表達2條干擾序列的質(zhì)粒載體,顯示出干擾效應(yīng)疊加的傾向。 第四部分,目的:在shRNA有效沉默TGF-β1情況下,觀察系膜細胞表達纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)n)和四型膠原(type Ⅳ collage,Col-Ⅳ)的動態(tài)變化。 方法:在表達TGF-β1 shRNA的pEGFP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SD大鼠系膜細胞后,
11、觀察系膜細胞表達Fn和Col-Ⅳ的變化及其與TGF-β1沉默效應(yīng)的關(guān)系,對于24hrs、48hrs和72brs系膜細胞的Fn mRNA表達及細胞培養(yǎng)上清中的Fn和Col-Ⅳ蛋白濃度,分別采用RT-PCR和ELISA方法動態(tài)觀察。 結(jié)果:在脂質(zhì)體Lipfectamine<'TM>2000刺激下,除了TGF-β1被有效沉默的2組外,各組系膜細胞分泌Fn顯著增加,并于24hrs達到峰值濃度,而TGF-β1被有效沉默的2組的Fn升高沒有
12、前者明顯(P<0.01),其峰值濃度被推遲到48hrs才出現(xiàn);各組的Fn mRNART-PCR半定量也呈現(xiàn)出類似的變化。各組系膜細胞蛋白提取液中ELISA測定Col-Ⅳ蛋白提示,TGF-β1被有效沉默的2組均出現(xiàn)了Col-Ⅳ的顯著下降,以24hrs、48hrs為明顯,72hrs仍有低于對照組的傾向,但無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論:shRNA沉默TGF-β1的表達,能夠顯著下訓(xùn)Col-Ⅳ的表達,延緩Fn峰值的出現(xiàn)。脂質(zhì)體Lipfectam
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