Cathepsin B在實驗性腦梗死灶周圍和遠隔部位損傷與修復中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 腦梗死的損害并不僅僅局限于梗死灶及其周圍組織，還波及遠隔部位，引起繼發(fā)變性。單純保護腦梗死灶及其周圍組織，而忽視腦梗死遠隔部位的治療將難以取得好的療效。對缺血腦組織進行保護治療時，不僅應重視對神經(jīng)細胞的直接保護，促使病變部位的血流恢復并重新建立血管網(wǎng)，也是神經(jīng)保護的基本前提。因此，促進病變部位的血管新生不失為神經(jīng)保護的重要策略。
　　 腦梗死灶周存在血管新生(angiogenesis)已經(jīng)得到公認，并被

2、認為與腦梗死的預后密切相關且能促進神經(jīng)再生(neurogenesis)。血管新生受血管生成調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)、內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)是其中最重要的兩個。前者是目前已知的最強的血管生成促進因子，后者則明顯抑制血管新生。有研究報道，腦缺血不僅促使梗死灶周VEGF表達升高，誘導新血管生成，還引起遠離梗死灶的組織表達VEGF。然而

3、，局灶腦梗死后遠隔損害的部位是否存在血管新生甚至神經(jīng)再生，二者在遠隔損害修復中起怎樣的作用？尚未見研究報道。
　　 組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)是細胞死亡的重要介導因子之一，參與梗死灶周組織損傷特別是凋亡過程。初步研究表明抑制CB能明顯減輕腦梗死灶周損害，是有前景的腦保護策略之一。然而，目前尚不清楚CB在腦梗死遠隔損害中的作用，也不清楚CB抑制劑腦保護的是否還有除了直接保護以外的機制。最近有研究提示，CB對VEG

4、F和ES的生成也有重要的調(diào)節(jié)作用，因而有可能可以通過調(diào)節(jié)CB的活性來促進腦梗死后的血管新生，實現(xiàn)對腦組織的保護和修復。
　　 研究目的：
　　 1.觀察成年高血壓大鼠皮層梗死灶周和梗死同側(cè)丘腦CB活性的變化，并探討腹腔注射CB抑制劑Ca-074ME對腦梗死周組織、同側(cè)紋狀體外側(cè)帶和丘腦腹后核(ventralposterior neuclus，VPN)的保護作用，以及對神經(jīng)功能恢復的影響。
　　 2.研究ES和VE

5、GF在梗死灶周和梗死灶同側(cè)VPN的血管新生調(diào)節(jié)中的作用及抑制CB對其生成的影響。
　　 3.初步探討皮層腦梗死同側(cè)VPN的血管新生和神經(jīng)再生的發(fā)生情況。初步觀察抑制CB對梗死灶周和同側(cè)VPN血管新生和神經(jīng)再生的影響。
　　 材料和方法：
　　 采用雄性S-D大鼠220只，用雙腎雙夾法復制易卒中型腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renal vascular hypertensive rats，RHRS

6、P)模型。造模成功后取148只用雙極電凝器閉塞右側(cè)大腦中動脈遠端(middle cerebral arteryocclusion，dMCAO)，制作皮層腦梗死模型。隨機取60只大鼠在dMCAO術后立即接受Ca-074ME腹腔注射一次(5mg/Kg，溶于1％DMSO)(Ca-074ME組)，另取60只接受等劑量的1％DMSO腹腔注射(DMSO組)，另隨機選取40只RHRSP大鼠進行假手術做為假手術對照組。隨機抽取部分大鼠進行神經(jīng)功能評估，

7、神經(jīng)功能評估采用Bederson評分和走橫木試驗。dMCAO術后6小時、24小時、3天、7天和14天，隨機從兩個dMCAO組中各取12只、從假手術組取8只大鼠處死，一半用于組織學檢測，另一半用于CB酶活性檢測。CB的酶活性檢測采用Z-Arg-Arg-AMC做為底物，結(jié)果以每分鐘每克組織釋放的游離AMC的nmol數(shù)表示。采用Nissl染色顯示組織形態(tài)并計算梗死體積，用免疫組織學方法檢測并半定量ES、VEGF以及血管內(nèi)皮標記物vWF和內(nèi)源性

8、神經(jīng)干細胞(neurral stem cells，NSCs)的標記物巢蛋白(Nestin)的表達情況。為明確ES、VEGF和CB表達細胞的類型以及ES、VEGF與CB的共定位關系，我們還進行了ES/神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase NSE，成熟神經(jīng)元的標記物)、ES/膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP，星形膠質(zhì)細胞的標記物)、VEGF/GFAP

9、、VEGF/神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nuclear proteinNeuN，成熟神經(jīng)元的標記物)、CB/NeuN、CB/GFAP、ES/CB以及VEGF/CB的免疫熒光雙標的檢測。同時，為明確ES表達與細胞凋亡的關系，我們還進行了ES與細胞凋亡的標記物--cleaved caspase-3(Asp175)的免疫熒光雙標記檢測。另外，我們還采用TUNEL法檢測了梗死灶周的細胞凋亡。所有圖像均使用NIHImage

10、 J1.31軟件進行分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)分布型數(shù)據(jù)以中位數(shù)、四分位數(shù)或百分率表示。全部數(shù)據(jù)均采用社會科學統(tǒng)計軟件包(Statistical Package for Social Sciences，SPSS) Windows11.0版進行統(tǒng)計，行單因素方差分析(ANOVA)和非參數(shù)檢驗，比較各組間的差異，P<0.05時，認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 CB酶活性：
　　 dMCAO

11、術后梗死灶周圍和梗死同側(cè)VPN的CB活性均增高，并呈動態(tài)改變：dMCAO術后6小時、24小時、3天、7天、14天，DMSO組梗死灶周CB活性測定值依次為：1.24±0.22、1.03±0.13、0.86±0.15、0.87±0.35、0.76±0.19nmol/g·min；Ca-074ME組為：0.93±0.20、0.87±0.24、0.89±0.27、0.83±0.16、0.79±0.21 nmol/g·min；假手術組為：0.72±

12、0.13、0.67±0.18、0.70±0.11、0.74±0.12、0.69±0.25 nmol/g·min；其中，dMCAO術后6小時和24小時兩個時間點，DMSO組與假手術組之間比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，并且，dMCAO術后6小時，Ca-074ME組和DMSO組比較差異也有統(tǒng)計學意義(P=0.012)。
　　 dMCAO術后，梗死同側(cè)丘腦CB活性亦出現(xiàn)變化，在dMCAO術后6小時短暫升高，以后回落，dMC

13、AO術后7天又升高，并在這一時間點，DMSO組的CB活性與假手術組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。(dMCAO術后6小時、24小時、3天、7天、14天，DMSO組、Ca-074ME組及假手術組大鼠丘腦的CB活性依次分別為：0.85±0.28、0.87±0.34、0.69±0.24、0.97±0.20、0.67±0.36和0.79±0.13、0.82±0.22、0.74±0.35、0.81±0.17、0.71±0.27以及0.6

14、3±0.10、0.69±0.21、0.65±0.30、0.64±0.18、0.72±0.15)。
　　 腦梗死體積：
　　 腹腔注射Ca-074ME能縮小腦梗死體積(dMCAO術后24小時、3天、7天、14天，Ca-074ME組和DMSO組梗死體積占全腦的體積百分數(shù)依次分別為：10.04±2.12、10.28±2.36、8.64±1.55、7.96±1.36和12.96±2.13、13.47±1.61、11.1±1.94

15、、9.70±1.75，前三個時間點，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義，P值依次為0.037、0.025、0.041。dMCAO術后14天，兩組梗死體積比較差異無明顯統(tǒng)計學意義，P=0.055)。
　　 神經(jīng)功能評分：
　　 Ca-074ME能改善皮層腦梗死大鼠的神經(jīng)功能：dMCAO術后3天的兩組的Bederson評分(中位數(shù)+/-四分位數(shù))分別為：Ca-074ME組2(1，3) VS DMSO組2(2，3)，兩組比較P=0.02

16、5； dMCAO術后3、7天，兩組的BMT評分(中位數(shù)+/-四分位數(shù))分別為：Ca-074ME組4.0(3，4.3)、4.7(3.3，5) VS DMSO組3.0(2，3.7)、4.0(2.7，4.3)，兩組在兩個時間點兩兩比較P值分別為0.043和0.040。
　　 梗死灶周細胞凋亡：
　　 TUNEL染色顯示，假手術組腦組織檢測末見細胞凋亡，dMCAO術后梗死灶周圍存在顯著的細胞凋亡，在dMCAO術后6小時即出現(xiàn)，到

17、dMCAO術后第3天最明顯。dMCAO術后24小時和第3天，Ca-074ME組梗死灶周細胞凋亡均顯著低于DMSO組(p值分別為0.046和0.040)。
　　 結(jié)論：
　　 1實驗性皮層腦梗死灶周及梗死灶同側(cè)丘腦CB活性升高，參與了局部損害形成。CB特異性抑制劑Ca-074ME能減少梗死灶周細胞調(diào)亡、縮小腦梗死體積、減輕同側(cè)紋狀體和VPN繼發(fā)變性，并改善神經(jīng)功能。
　　 2實驗性皮層腦梗死灶周ES表達升高，參與調(diào)